骨关节炎改良Hulth模型的实验研究

骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是多种因素引起的以关节软骨退变和软骨下骨重塑及骨赘形成为病理特征的关节疾患。近年来,OA的发病率逐年增高,已成为老年人致残的主要疾病之一。合适的动物模型是大规模开展OA基础和临床研究的基石。几十年来国内外相继报道了多个动物模型,然而各个模型的系统研究仍待深入。既往研究已证实OA患者的血液及关节液的成分较正常人及其他炎性关节病有明显的不同,说明随着OA的发生、发展,病变可以通过体液环境反映出来,进而对体液环境产生重要的影响。反之,参与关节疾病的各种细胞生活在改变了的体液环境中,必然会因对环境产生变化。本试验通过改良Hulth法造模后,对此模型进行了系列研究,并比较不同时期骨关节炎兔血清对软骨细胞和骨髓间充质干细胞增殖的影响,为探讨骨关节炎的发病机制及骨关节炎软骨修复时机等提供实验依据。 目的:1.通过观察改良Hulth法造模后不同时期兔膝关节的大体和病理特点,研究其复制不同时期骨关节炎的可行性;2.对造模后不同时期兔血清NO含量、软骨细胞凋亡率及软骨Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA进行检测,为此模型提供实验依据并探讨骨关节炎发病机制;3.对造模不同时期软骨细胞进行培养,并观察不同时期骨关节炎血清环境对正常软骨细胞和骨髓间充质干细胞增殖的影响,进而探讨血清学环境与骨关节炎发病及软骨修复的关系。 方法:1.取成年新西兰大白兔16只,雌雄各半,随机分组,对Hulth造模法进行改良,将兔右膝关节作为实验侧,作膝关节前交叉韧带切断、内侧半月板切除,左膝作为对照侧。分别于造模后2,6,10,14周时观察膝关节的大体和组织病理学特点。软骨病理采用Mankin评分进行评定。2.提取造模前及造模后不同时期兔血清,冷冻保存,参照改良Gress法对血清NO含量进行检测。3.采用TUNNEL软骨细胞凋亡检测法,对造模后不同时期骨关节炎软骨细胞凋亡情况进行流失细胞仪检测。4.应用RT-PCR的方法,检测造模后不同时期骨关节炎软骨与正常软骨collagenⅡ和aggrecan的表达情况,β-actin作为内参照。5.采用酶消化培养法对造模后不同时期,实验侧及对照侧膝关节软骨细胞进行消化培养,利用倒置相差显微镜观察体外培养的软骨细胞的形态学变化和生物学特性,采用MTT法检测其细胞增殖情况。6.取冻存的正常及造模后不同时期兔血清,与正常幼兔软骨细胞和骨髓间充质干细胞进行培养,倒置显微镜观察细胞形态学变化,MTT法检测细胞增殖情况。 结果:1.对照各组各时间点Mankin评分无统计学差异（P＞0.05）,造模各组与对照组,及造模各组间Mankin评分有统计学差异（P＜0.01）;2.正常组和造模2周组与造模6周、10周、14周组血清NO含量有统计学差异（P＜0.01）,造模6周、10周及14周组间无统计学差异（P＞0.05）;3.经χ2检验各时间点软骨细胞凋亡率有统计学差异（P＜0.01）;4.造模各组与正常组相比,及造模各组之间collagenⅡ和aggrecan mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.01）。5.各时间点实验侧与对照侧原代软骨细胞增殖活性有统计学差异（P＜0.01）。尤其是造模10周时,有明显差异（P＜0.001）6.不同时期骨关节炎兔血清对正常软骨细胞和MSC细胞形态和增殖有重要影响。 结论:（1）采本研究通过改良Hulth模型,14周内成功复制出膝不同时期骨关节炎,证实了此种改良方法的可行性;血清NO含量增高,NO含量造模6周后与病理分期无明确相关。而随着病理分级进展,软骨细胞凋亡率相应增加;Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达,造模一段时间都有增高的趋势,在造模10周达到最高峰,然而在极晚期病变出现时,又都快速下降,与病理进展有一定相关性;（2）本实验采用原代软骨细胞机械分离及胰蛋白酶、Ⅰ型及Ⅱ胶原酶的序贯、联合消化法,可以对骨关节炎原代软骨细胞进行良好的分离和传代培养。体外培养在造模中晚期,病变侧软骨细胞增殖能力强于正常对照侧,且形态学差异不大。并提出采用骨关节炎软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞来源的可能性;（3）本研究发现,造模不同时期骨关节炎兔血清对正常软骨细胞和骨髓间充质干细胞的生物学行为具有重要的影响。血清对这两种细胞的生物学影响有差异。且造模2周、14周和6周、10周血清具有不同的特性。血清学环境对骨关节炎的发病机制及软骨修复的影响有待进行深入的研究。