气阴两虚型IgA肾病患者的肾系膜细胞的蛋白质组学研究

目的： 1、实验研究 创建正常人及气阴两虚型IgA肾病患者的血清IgA1刺激人肾系膜细胞的蛋白质组学图谱,并分析表达有差异的蛋白。一方面试图寻找IgA肾病的特异性生物标志物,探索IgA肾病无创伤性诊断的可能性；另一方面筛选药物治疗IgA肾病的可能靶点,提高IgA肾病的临床治疗有效率。 2、临床研究 观察IgA肾病临床常见证型的症状积分、理化指标、病理变化与IgA肾病病理分型间的关系,为IgA肾病的诊断、治疗及推测预后提供参考。 方法： 1、实验研究 (1)、Jacalin亲和层析联合Sephacryl S-200HR分子筛层析分离正常人及IgA肾病患者血清IgA1并用Westernblot方法鉴定之； (2)、三层筛网法分离人胚胎肾小球,并用Ⅳ型胶原酶消化处理,以培养原代肾小球系膜细胞(GMC)。细胞化学免疫方法检测亚代GMC的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)、Ⅷ因子相关抗原的表达； (3)、双向电泳技术分离气阴两虚型IgA肾病患者与正常人血清algA1刺激肾系膜细胞的蛋白质,凝胶用银染显色,扫描仪获取凝胶图像并对其进行软件分析,并找出差异蛋白点,对差异蛋白点进行胶内酶切,质谱分析,获得肽质量指纹图,通过相关蛋白质数据库进行检索,鉴定蛋白质。 2、临床研究 将70例IgA肾病患者进行辨证分型,分为虚证(气阴两虚、脾肾气虚、肝肾阴虚)、实证(水气、湿热、湿浊)、虚实夹杂(脾肾气虚夹湿浊／夹淤血)等证型,并进行中医症状积分、临床指标的收集,同时对其中45例患者的肾穿刺活检病理报告进行病理分型的归纳和Katafuchi IgA肾病积分评估其病理损害,并分析这些指标间的相关性。 结果： 1、实验研究 (1)、利用Jacalin亲和层析联合SephacrylS-200HR分子筛层析成功分离了正常人及气阴两虚型IgA肾病患者血清IgA1,并且有较高的回收率和纯度； (2)、原代培养的人胚胎肾小球系膜细胞生长良好,免疫化学细胞证实抗α-SMA及抗Vimentin染色阳性,抗Cytokeratin、抗Ⅷ因子抗原染色为阴性。 (3)、初步建立了正常人及气阴两虚型IgA肾病患者的血清IgA1刺激肾系膜细胞的蛋白质组学图谱,其中IgA肾病组蛋白点有(602±13)个,匹配率95.97%；正常人组蛋白质点(569±5)个,匹配率93.27%。经软件分析,IgA肾病组和正常组比较表达大于3倍的点有22个,此外还有8个点仅表达于IgA肾病组,6个点仅表达于正常组。质谱分析共鉴定了8种有明确功能的蛋白质,它们分别属于热休克蛋白、信号转导蛋白、纤连蛋白、半乳糖凝集素及代谢酶类。另外,鉴定了1种未知功能蛋白,4种无意义蛋白。其中热休克蛋白、信号转导蛋白及未知蛋白仅表达于气阴两虚型IgA肾病组,纤连蛋白及半乳糖凝集素仅表达于正常人组。 2、临床研究 (1)、IgA肾病患者虚证、虚实夹杂及实证组年龄、性别方面差异无统计学意义(P＞0.05),但虚证组及虚实夹杂组病程明显长于实证组,差异有统计学意义(P＜0.05)； (2)、中医证型与病理：虚证、虚实夹杂证与肾组织病理分级之间有一定的相关性(P=0.032＜0.05),且多见于Hass分型的Ⅱ～Ⅳ型；实证患者的病理分级多见于Hass分型的Ⅰ-Ⅱ型； (3)、中医症候积分与病理分级：随着病理分型的递增,中医症候积分也在增高。经方差分析,各组间差异有统计学意义(P＜0.05)； (4)、实验室指标与病理分级：随着病理分型的增加,尿潜血、尿蛋白、尿蛋白定量、尿素氮、尿酸、肌酐等指标亦随着增加,各型间除尿蛋白定量差异有统计学意义(P＜0.05)外；其它各指标间差异没有统计学意义(P>0.05); IgA,IgG, IgM, C3, C4, CRP, RF, ASO, ESR, TG, CHOL等指标随着病理分型的增加,变化趋势不明显,差异没有统计学意义(P＞0.05)。 结论： 1、实验研究 正常人及气阴两虚型IgA肾病患者的血清IgA1刺激人肾小球系膜细胞的蛋白质表达有差异,这些差异蛋白有可能有助于揭示IgA肾病的发病机制,或发现IgA肾病特异性生物标记物,亦或发现药物治疗IgA肾病的可能靶点。 2、临床研究 (1)、IgA肾病以虚证最多,虚证中又以气阴两虚最为多见；其次是虚实夹杂证,以脾肾气虚夹湿浊／湿热／淤血最为常见,实证病例最少； (2)、中医症候积分、病理损害积分随着IgA肾病病理分型的递增而递增,两者间呈正相关； (3)、实验室指标与病理分级：各型间尿蛋白定量差异有统计学意义(P＜0.05),提示尿蛋白定量是IgA肾病预后的独立危险因素。