管花肉苁蓉鲜品化学成分及生物活性的研究

管花肉苁蓉「Cistanche tubulosa (Schenk) Wight」为2005和2010版《中国药典》肉苁蓉的新增基原植物,是目前市场流通量最大的肉苁蓉药材,具有滋肝养肾,益精血,润肠通便的功效。在新疆等肉苁蓉产地,当地人们常食用肉苁蓉鲜品,以达到补益、延寿、抗疲劳等作用。本论文采用活性跟踪分离等现代天然药物研究思路和方法,对管花肉苁蓉鲜品的化学成分和药理活性进行了系统研究,旨在为该药材的进一步资源开发和临床应用提供详实的化学和药理学信息。 体内实验研究表明,管花肉苁蓉鲜品甲醇提取物具有保肝作用,可降低D-GalN/LPS诱导的肝损伤模型小鼠的sAST和sALT增长。采用体外D-GalN诱导原代培养小鼠肝细胞和TNF-α诱导L929细胞为筛选模型,以细胞毒抑制率为评价指标,筛选出管花肉苁蓉鲜品甲醇提取物经HP-20大孔吸附树脂柱色谱的甲醇洗脱馏分为抑制细胞毒性的活性部位。 通过硅胶柱色谱、开放ODS柱色谱、制备HPLC色谱等多种现代色谱分离手段,从管花肉苁蓉鲜品甲醇提取物的保肝活性部位中分离得到53个化合物。通过理化常数测定、波谱测定分析等方法,鉴定了它们的结构,分别为：kankanosides H1、H2、I、J1、J2、K1、K2、L、M、N、O、P (1-12)、松果菊苷(echinacoside,13)、毛蕊花糖苷(acteoside,14)、异毛蕊花糖苷(isoacteoside,15)顺式毛蕊花糖苷(cis-acteoside,16)、2乙酰毛蕊花糖苷(2'-acetylacteoside,17)、去咖啡酰基毛蕊花糖苷(decaffeoylacteoside,18)、管花苷A (tubuloside A,19)、管花肉苁蓉苷B1、B2 (cistantubulosideB1, B2,20,21)三糖苯丙素苷(arenarioside,22)、wiedemanninoside C (23)、campneosideⅠ(24)、campneosideⅡ(25,26)、isocampneosideⅠ(27,28)、红景天苷(salidroside,29)、丁香苷A 3′-α-L-吡喃鼠李糖苷(syringalide A 3'-α-rhamnopyranoside,30)、管花肉苁蓉苷A (cistantubulosideA,31)、肉苁蓉苷F (cistanoside F,32)、kankanose (33)、松柏苷((E)-coniferin,34)、丁香苷(syringin,35).芥子醛葡萄糖苷(sinapaldehyde glucoside,36)、(+)-pinoresinol O-β-D-glucopyranoside (37)、eucomminA (38)、isoeucommin A (39)、丁香脂素-O-β-D-吡喃葡萄糖苷((+)-syringaresinol O-β-D-glucopyranoside,40)、巴尔蒂苷(bartsioside,41)、格鲁苷(gluroside,42)、6-去氧梓醇(6-deoxycatalpol,43)、kankanoside A (44)、8-表去氧马钱酸(8-epideoxyloganic acid,45)、京尼平苷酸(geniposidic acid,46)、玉叶金花苷酸(mussaenosidic acid,47)、8-表马钱酸(8-epiloganic acid,48)、(2E,6E)-8-hydroxy-2,6-dimethyl-2,6-octadien-1-yl-O-βD-glucopyranoside(49)、(2E.6E)-3,7-dimethyl-8-hydroxyl-octadien-1-yl-O-β-D-glucopyranoside (50))、betulalbuside A (51)、kankanoside E (52)和(2E,6Z)-8-O-β-D-glucopyranosyloxy-2,6-dimethyl-2,6-octadienoic acid (53)。其中化合物1～12为未见文献报道的新化合物,化合物16、22、23、27、28、34、36、38、39、49、50和51为首次从肉苁蓉属植物中分离得到,化合物45为首次从该种植物中分离得到。 测定了从管花肉苁蓉鲜品活性部位中分离得到的20个单体化合物对D-GalN诱导原代培养小鼠肝细胞的细胞毒抑制活性,结果显示：17个苯乙醇苷和1个苯丙烯酰寡糖化合物具有抑制作用,其中苯乙醇苷化合物松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2′-乙酰毛蕊花糖苷、管花苷A、管花苷B和kankanoside G抑制作用较强于阳性对照化合物水飞蓟宾。测定了松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α和NO释放的影响,结果表明3种化合物对TNF-α和NO释放无显著抑制活性。测定了从管花肉苁蓉鲜品活性部位中分离得到的25个单体化合物对TNF-α诱导L929细胞的细胞毒抑制活性,结果显示：9个苯乙醇苷、4个环烯醚苷、1个单萜苷和1个木脂素苷化合物具有抑制活性,其中松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2′-乙酰毛蕊花糖苷、管花苷A、管花肉苁蓉苷B1抑制作用强于阳性对照化合物水飞蓟宾。以上结果提示：上述结果提示,松果菊苷等成分对D-GalN/LPS诱导的小鼠肝损伤保护作用与降低肝细胞对TNF-a敏感性有关,而与抑制TNF-a的释放无关。由此推测,苯乙醇苷成分显示的保肝作用不是通过抑制TNF-α的释放,而是依赖于降低肝细胞对TNF-α的敏感度。 选取体外细胞毒抑制活性强的主要肉苁蓉苯乙醇苷化合物(松果菊苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷)进行D-GalN/LPS诱导的小鼠肝损伤保护实验,结果表明：3种化合物高剂量组对模型中sAST升高均有显著抑制作用(p<0.01),毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷高剂量组对sALT升高亦有显著抑制(p<0.05),可见苯乙醇苷成分是管花肉苁蓉保肝活性的主要药效成分。 根据活性测定结果,解析了管花肉苁蓉苯乙醇苷成分体外抗细胞毒作用构效关系：苷元结构是细胞毒抑制活性的必要结构；苷元上3.4-二羟基取代对细胞毒抑制活性有增强作用；苷元上7位甲氧基和内侧葡萄糖6′位糖苷化对细胞毒抑制活性有减弱作用。 根据分离得到的苯乙醇苷化合物的谱学数据,结合文献,对肉苁蓉属中苯乙醇苷类化合物的结构特点、波谱特征和生合成途径进行了归纳总结。