刺五加诱导肾癌细胞786-O凋亡的研究

刺五加[Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms]为五加科植物,是入载我国药典的传统中药具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、改善血液流变学、保护心肌缺血、提高吞噬细胞的吞噬活力、治疗关节炎、治疗神经衰弱等多种药理活性。肾癌在泌尿生殖系肿瘤中的发病率仅次于膀胱癌而居第二位,对放疗、化疗及内分泌等治疗均不敏感,从天然产物中寻找抗肿瘤药物是当前研究热点之一,刺五加叶未入载药典,是否具有与传统药用部位具有相似的药用价值,本文试以人肾透明细胞腺癌细胞株786-O为对象,就刺五加叶对人肾癌细胞786-O的增殖抑制作用及诱导凋亡的作用机理进行初探。 本文首先对刺五加叶的主要成分进行分析和含量测定,其中黄酮含量为:13.47%±0.5,皂苷含量为:4.17%±0.3,多糖含量为:1.94%±0.002,脂类含量为:2.09%±0.0006,与报道的传统药用部位含有与人参等相似的多种皂苷、多糖、黄酮等药理成分基本吻合。 为探寻刺五加叶中最佳抗肾癌细胞的有效成分,首先从刺五加叶中分离得到刺五加叶水提物(WEAS)、刺五加叶醇提物(EEAS)、刺五加叶黄酮(ASF)、刺五加叶石油醚提取物(PEEAS)、刺五加叶皂苷(ASS)等五种成分。采用MTT法、SRB法观察了这五种成分体外对于786-O肾癌细胞生长的抑制作用,结果表明刺五加叶皂苷对786-O细胞增殖的抑制作用最为明显,刺五加石油醚提取物和刺五加叶醇提物次之,刺五加叶水提物作用稍弱,而刺五加叶黄酮在0-120μg/mL剂量范围786-O细胞生长几乎无影响。并进一步采用MTT法比较了刺五加叶皂苷对人胚胎肾细胞HEK-293体外生长的影响,结果显示:20-100μg/mL的ASS对于786-O细胞具有显著的抑制作用和明显的剂量依赖关系;1-150μg/mL的ASS对于人胚胎肾细胞几乎无细胞毒作用。 为进一步确定ASS体外诱导786-O肾癌细胞凋亡的作用,研究采用光镜直接观察、wright染色法、吖啶橙染色法、DAPI染色法和透射电子显微镜观察了ASS作用肿瘤细胞后细胞形态和超微结构的变化;利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA的片断化;应用碘化丙啶(PI)染色的流式细胞术法检测了ASS对786-O细胞周期的影响;结合免疫荧光标记,以流式细胞术检测ASS作用后细胞抗细胞凋亡蛋白Bcl-2含量的影响;免疫荧光染色法检测NF-κB激活—核转运。结果显示:①786-O细胞经ASS作用后呈早期凋亡特征:细胞变小皱缩,核固缩、浓聚,核仁裂解,染色质凝集边集,可见凋亡小体等;但琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术结果表明,ASS致786-O细胞凋亡率不高。②细胞周期呈一定的变化,G0/G1期细胞明显增加,S期细胞减少,说明ASS可将786-O阻滞在G0/G1期。③抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调,这可能是ASS诱导786-O肾癌细胞凋亡的分子机理之一。④ASS诱导786-O细胞凋亡可能不是通过NF-κB信途径。 本研究初步证实了ASS能诱导786-O肾癌细胞凋亡,同时探讨了ASS诱导凋亡786-O肾癌细胞凋亡作用机制及信号途径,结果表明可能与细胞周期的改变及细胞抗细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达下调有关,而并不通过NF-κB信号途径。这为进一步从分子水平揭示ASS诱导凋亡的途径一定的理论依据。