透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞周期与凋亡影响的研究

目的 探讨透骨消痛胶囊含药血清影响软骨细胞周期与凋亡的作用机制。 方法 1.新西兰大白兔60只,抽签法随机分为空白组(0.9%生理盐水灌胃)、对照组(壮骨关节丸5 mg／ml溶液灌胃)、实验1组(透骨消痛胶囊2.5 mg／ml溶液灌胃)、实验2组(透骨消痛胶囊5 mg／ml溶液灌胃)、实验3组(透骨消痛胶囊10mg／ml溶液灌胃),20m1／次,2次／天,连续3天,腹主动脉采血,制备含药血清。 2.新西兰大白兔32只,取膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞,甲苯胺蓝染色、RT-PCR检钡CollageⅡmRNA鉴定。第3代软骨细胞同步化,抽签法随机分为空白组、对照组、实验1组、实验2组、实验3组,分别加入含15%各组血清DMEM培养24 h、48 h、72h,MTT检测软骨细胞的活性,流式细胞仪检测软骨细胞周期的分布,确定含药血清的有效干预时间。第3代软骨细胞同步化,抽签法随机分组分别加入含15%各组血清DMEM培养72 h,荧光倒置相差显微镜、光学显微镜、透射电子显微镜观察软骨细胞的形态结构,RT-PCR检测软骨细胞CyclinD1、CDK4、p21 mRNA表达。 3.第3代软骨细胞培养72 h,抽签法随机分为凋亡1组(SNP终浓度0 mmol／L)、凋亡2组(SNP终浓度0.5 mmol／L)、凋亡3组(SNP终浓度1 mmol／L)、凋亡4组(SNP终浓度2 mmol/L)干预24 h,荧光倒置相差显微镜观察软骨细胞的形态结构,Hocehst 33342染色鉴定软骨细胞的凋亡,MTT检测软骨细胞的活性,确定SNP诱导软骨细胞凋亡的量效关系。 4.第3代软骨细胞培养72 h,抽签法随机分为空白组、对照组、实验1组、实验2组、实验3组,分别加入含SNP终浓度为1 mmol／L 15%各组血清DMEM培养12 h、24 h、36h,MTT检测软骨细胞的活性,确定含药血清的有效干预时间。第3代软骨细胞培养72 h,抽签法随机分组分别加入含SNP终浓度为1 mmol/L 15%各组血清DMEM培养24 h,MTT检测软骨细胞的活性,Hocehst 33342染色检测软骨细胞的凋亡率,荧光倒置相差显微镜、透射电子显微镜观察软骨细胞的形态结构,Annexin V-FITC/PI检测软骨细胞的早期凋亡,RT-PCR检测软骨细胞p53、Bcl-2 mRNA表达,比色法检测软骨细胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活性。 结果 1.原代、第2代、第3代软骨细胞甲苯胺蓝染色,胞浆内呈紫红色异染颗粒；原代、第2代、第3代、第4代、第5代软骨细胞CollageⅡmRNA表达逐渐降低,原代、第2代、第3代明显高于第4代、第5代(P<0.01)。透骨消痛胶囊含药血清促进软骨细胞增殖的有效作用浓度为15%,有效作用时间为72 h；干预72 h,软骨细胞的表型稳定；软骨细胞OD值,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05)；软骨细胞CyclinD1、CDK4 mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05)；软骨细胞p21mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显低于空白组(P<0.05)。 2.干预24 h,SNP诱导软骨细胞凋亡的有效作用浓度为1 mmol/L。透骨消痛胶囊含药血清抑制软骨细胞凋亡的有效作用时间为24 h；干预24 h,软骨细胞OD值,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05)；软骨细胞的凋亡率,对照组、实验2组、实验3组明显低于空白组(P<0.05)；软骨细胞p53 mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显低于空白组(P<0.05)；软骨细胞Bcl-2 mRNA表达,对照组、实验2组、实验3组明显高于空白组(P<0.05)；软骨细胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活性,对照组、实验2组、实验3组明显低于空白组(P<0.05)。 结论 1.透骨消痛胶囊含药血清能上调软骨细胞周期正向调节因子CyclinD1、CDK4表达,下调负向调节因子p21表达,加速软骨细胞周期关键限制点G1/S期的切换,促进软骨细胞周期的进程,并能维持软骨细胞的表型稳定。 2.透骨消痛胶囊含药血清能下调软骨细胞促凋亡基因p53、Caspase-9、Caspase-3表达,上调抗凋亡基因Bcl-2表达,抑制软骨细胞线粒体凋亡通路的信号转导。