TRPC6介导的钙离子内流在白蛋白过负荷所致足细胞损伤中的作用

蛋白尿不仅是足细胞损伤的主要临床表现,也是导致足细胞损伤进行性发展的重要原因之一。白蛋白是尿蛋白的主要成分,已有的实验研究主要集中在其对肾小管上皮细胞的损伤如诱导其凋亡以及促进肾间质纤维化,而其在足细胞的直接损伤中作用尚未引起足够重视。蛋白尿状态下,足细胞首先暴露在大量白蛋白的环境中,其呈指状交叉的足突结构以及足突间裂孔隔膜分子可能受到蛋白负荷的影响而加剧足细胞的损伤,同时足细胞的损伤又将导致蛋白尿病情加重,如此形成恶性循环。TRPC6是新近发现的足细胞裂孔隔膜蛋白之一,也是一种非选择性阳离子通道蛋白,其主要通过介导钙离子内流发挥作用。已有的研究证实,在多种蛋白尿性肾脏病以及足细胞损伤的体外模型中足细胞TRPC6表达量增高,并与足细胞损伤程度相一致。由此推测TRPC6介导的钙离子内流是足细胞损伤的始动因素之一。然而,白蛋白过负荷对TRPC6离子通道功能的影响及其对足细胞的直接作用至今尚未明确。 本研究拟采用白蛋白过负荷体外细胞模型,探讨TRPC6在白蛋白过负荷所致足细胞损伤中的作用,并初步研究TRPC6通道在白蛋白过负荷状态下功能和表达量的改变,以期进一步阐明TRPC6介导的钙离子内流在蛋白尿所致足细胞损伤中的作用机理,并为蛋白尿的治疗提供潜在靶点。本实验研究具体内容概述如下： 目的：探讨TRPC6在白蛋白过负荷所致足细胞损伤中的作用。 方法：体外培养条件永生化小鼠足细胞,分为：空白对照组；白蛋白刺激组；pEGFP-N1转染组；TRPC6高表达质粒mTRPC6-EGFP转染组；scramble siRNA转染组;TRPC6 siRNA转染组；TRPC通道阻滞剂SKF-96365干预组；F-actin细胞骨架稳定剂Jasplakinolide干预组。(1)以Fluo 3-AM为钙离子探针,采用活细胞钙成像法检测白蛋白瞬时刺激对各组足细胞胞内钙离子浓度的影响。(2)Western blot法检测白蛋白过负荷后足细胞孔隔膜分子TRPC6和nephrin,内质网应激相关蛋白GRP 78以及caspase-12表达的的改变。(3)免疫荧光法检测白蛋白过负荷对足细胞损伤标志物desmin表达的影响。(4)以罗丹明标记的鬼笔环肽对足细胞F-actin细胞骨架染色,观察白蛋白过负荷对足细胞F-actin细胞骨架结构的影响。(5)Hoechst 33342活细胞染核观察白蛋白过负荷引发的足细胞凋亡及其细胞核形态的改变。(6)采用AnnexinV-FITC和propidium iodide双染法以流式细胞仪检测白蛋白过负荷所致足细胞凋亡率的改变。 结果：(1)大量白蛋白瞬时刺激可激发足细胞胞浆内钙离子浓度短时间内—过性增高,且呈白蛋白浓度依赖性。20 mg/ml白蛋白刺激引起的胞内钙离子增加幅度最为明显。分别以EGTA或thapsigargin预处理,以清除细胞外钙或阻断细胞内钙池,发现白蛋白刺激不但可激发细胞外钙离子内流还可引起胞内钙池钙离子释放。转染TRPC6高表达质粒后,足细胞对白蛋白刺激敏感性增加。而TRPC6 siRNA或TRPC通道阻滞剂SKF-96365可明显阻断白蛋白刺激引发的足细胞胞内钙离子浓度增高。(2)白蛋白过负荷后48 h,足细胞TRPC6蛋白表达量明显增高。而TRPC6 siRNA可明显抑制TRPC6蛋白表达。(3)20 mg/ml白蛋白孵育后48 h可引起足细胞desmin蛋白表达量显著增高,阻断TRPC6可改善desmin蛋白表达。(4)72 h白蛋白过负荷可导致足细胞F-actin细胞骨架结构破坏,与F-actin稳定剂jasplakinolide作用类似,阻断TRPC6可在一定程度上稳定足细胞骨架结构。(5)白蛋白过负荷48 h后足细胞GRP 78蛋白表达量增加,延长白蛋白刺激时间至72 h后足细胞内活化的caspase-12表达量增高。TRPC6 siRNA可部分阻断GRP 78蛋白表达和caspase-12蛋白活化。(6)20 mg/ml白蛋白孵育后96 h,足细胞凋亡数目明显增加,其形态学表现为细胞核呈质密浓染或碎片状质密浓染。(7)流式细胞仪分析结果显示,白蛋白过负荷引起足细胞凋亡率增加。阻断TRPC6蛋白表达或其通道功能,以及稳定足细胞骨架结构可降低足细胞凋亡率。 结论：(1)大量白蛋白瞬时刺激足细胞可引起TRPC6介导的钙离子内流增加。(2)长时间白蛋白过负荷可增加TRPC6蛋白表达量,引起足细胞骨架结构破坏,诱发足细胞内质网应激反应并最终导致足细胞凋亡。(3)干预TRPC6表达或阻断其通道功能可减少白蛋白过负荷引发的足细胞损伤,TRPC6可能成为治疗蛋白尿的新靶点。