银翘散主要药物活性成分调节流感病毒感染小鼠免疫失衡的实验研究

目的： 进行银翘散主要药物金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物中抗病毒活性成分的定性与定量研究，并研究药物对流感病毒诱导小鼠肺炎的治疗作用，包括抗流感病毒的配伍关系、时效关系及量效关系，初步探讨药物调节流感病毒感染小鼠免疫失衡、抗流感病毒感染的作用机制，为运用中医药防治小儿流感提供理论和实验依据。 方法： 采用薄层色谱法进行银翘散主要药物金银花、连翘、牛蒡子及其配伍醇提物中抗病毒活性成分的定性研究，并采用HPLC进行上述成分的定量研究。 应用鼻腔感染流感病毒诱导小鼠流感病毒肺炎模型，分别进行药物配伍关系、时效关系及量效关系实验，并与正常对照组、病毒对照组、病毒唑组对比观察，研究药物对小鼠一般状态、肺指数、肺组织病理改变的影响；采用RT-PCR技术检测各组小鼠给药后肺组织中流感病毒RNA复制及IFN-γmRNA的表达情况，探讨药物抑制病毒复制和诱生干扰素的作用；ELISA法检测肺组织IL-2，IL-12含量；免疫组化法检测肺组织中IFN-γ和IL-4蛋白表达，探讨药物抗流感病毒感染的细胞免疫机制以及对T细胞亚群平衡的影响。 结果： 1．银翘散主要药物活性成分的定性实验研究表明，银翘散主要药物醇提物中均含有抗病毒成分绿原酸、连翘苷及牛蒡苷，并应用HPLC进行了定量研究，证明了单味药含有上述成分最高。 2．病毒唑与银翘散主要药物均有一定的抗流感病毒作用，与病毒感染对照组相比，可降低肺指数；改善小鼠肺病理变化；流感病毒RNA复制减少及IFN-γmRNA的表达适度增加。ELISA法及免疫组化检测各组小鼠T细胞亚群中Th1因子IL-2、IL-12、IFN-γ分泌增加，Th2因子IL-4分泌减少。 ①药物配伍关系研究表明： 一般状态：正常对照组动物状态最好，以后依次是病毒唑组、1号药组、2号药组、3号药组、4号药组、5号药组、6号药组、7号药组，病毒对照组状态最差。 肺指数：与正常对照组比较，病毒对照组有显著差异(P＜0.05)。与病毒对照组比较，中药各组与病毒唑组均有显著差异(P＜0.5)。与病毒唑组相比，中药1号药组、2号药组、3号药组、4号药组、5号药组、6号药无显著差异(P＞0.05)，7号药组有显著差异(P＜0.05)，说明中药与病毒唑均可减轻肺指数。 肺组织外观：正常对照组肺组织外观良好，其次是病毒唑组、1号药组、2号药组、3号药组、4号药组、5号药组、6号药组肺组织外观相似，7号药组较其它中药组略重，以病毒对照组肺组织外观改变最大。 肺病理：正常对照组无异常，表现为肺泡腔大小较一致，管腔无分泌物，肺泡壁不增厚；病毒唑组改变最轻，肺泡壁上有少量毛细血管扩张充血，少量炎细胞浸润，肺泡壁略增厚。1号药组肺泡壁上有毛细血管扩张充血，较西药组略重。其余各组2号药组、3号药组、4号药组、5号药组、6号药组、7号药组改变较1号药重，表现为单核细胞浸润，肺泡壁增厚，有多个单核细胞浸润，较模型组明显减少。其中7号药组改变相对严重。病毒对照组肺病理改变最重，表现为支气管上皮脱落，管壁血管扩张充血，有炎细胞浸润；肺泡壁毛细血管扩张充血，有大量单核细胞浸润。 RT-PCR检测病毒核酸，除正常对照组外，各组药物肺组织中均有Ⅳ—RNA表达，与正常对照组比较，病毒对照组有显著差异，P＜0.05。与病毒对照组比较，中药各组与病毒唑均有显著差异，说明干预药物均可抑制病毒复制。与病毒唑比较，1号药无显著差异(P＞0.05)，余中药组有显著差异(P＜0.05)。 RT-PCR检测IFN-γmRNA表达，正常组有少量产生，其余各组小鼠IFN-γ均有所升高，与病毒对照组比较，各中药组和病毒唑有显著差异(P＜0.05)，与病毒唑组比较，中药各组水平不同，1号药组、2号药组、3号药组、5号药组、6号药组无显著差异(P＞0.05)，4号药组、7号药组有显著差异(P＜0.05)。 ②1号药时效关系研究表明： 1号药与西药病毒唑均有抗流感病毒作用，在小鼠流感病毒感染后不同时间，对其一般状态、肺指数、肺部外观、病理改变以及肺组织IL-2，IL-12含量的影响不同。 1d：与正常对照组比较，各组小鼠肺指数无明显增加(P＞0.05)，说明流感病毒感染后一天，尚未引起小鼠肺肿大。各组小鼠肺组织外观无差异。病毒对照组肺病理开始有变化，肺泡壁略增厚，有单核细胞浸润。其余各组肺组织病理改变不明显。正常对照组有少量IL-2分泌，与之比较，病毒对照组无显著差异(P＞0.05)，1号药组、病毒唑组开始增高，与正常组比较有显著差异(P＜0.05)，但两者之间无显著差异(P＞0.05)。正常对照组有少量IL012分泌，与之比较，各组之间IL-12分泌有显著差异(P＜0.05)；与病毒对照组比较，各组均有显著差异(P＜0.05)。 3d：与正常对照组比较，各组小鼠肺指数均有所增加，有显著差异(P＜0.05)，说明小鼠感染流感病毒3d后，病毒在肺组织中已增殖引起炎症反应导致肺肿大。与病毒对照组比较，病毒唑组和1号药组肺指数均降低。说明病毒唑和1号药均能减轻小鼠肺部炎性病变。肺组织外观正常对照组无变化，其余三组开始出现变化，依病毒唑组、1号药组、病毒对照组逐渐加重。正常对照组肺病理无异常；病毒对照组肺泡壁增厚，有单核细胞浸润；1号药组与病毒唑改变相似，表现为肺泡壁略增厚，有单核细胞浸润。与正常对照组比较，流感病毒感染后，各组小鼠分泌IL-2上升(P＜0.05)；与病毒对照组比较，1号药组、病毒唑组分泌IL-2显著提高(P＜0.05)，此两组之间亦有显著差异(P＜0.05)。与正常对照组比较，流感病毒感染后，各组小鼠分泌IL-12与1d不同，数值均有所升高，但1号药较病毒唑组和病毒对照组升高明显。与病毒对照组比较，1号药组、病毒唑组有显著差异(P＜0.05)，此两组之间亦有显著差异(P＜0.05)，1号药组分泌量增多。 5d：与正常对照组比较，病毒对照组肺指数明显增加(P＜0.05)，说明小鼠感染流感病毒后肺部炎症明显。与病毒感染模型组比较，病毒唑组和1号药组肺指数均降低(P＜0.05)。说明病毒唑和1号药均能显著减轻小鼠肺部炎性病变。肺组织外观：正常对照组仍无变化，其余三组变化较大，依病毒唑组、1号药组、病毒对照组逐渐加重。肺病理：正常对照组无异常；病毒对照组表现为肺泡壁增厚，有大量单核细胞浸润，形成实变区。1号药组支气管周围有部分肺泡壁增厚，有单个核细胞浸润，病变与病毒对照组相比有明显减轻；病毒唑组改变最轻，支气管周围有单个核细胞浸润，与病毒对照组相比有明显减轻。与正常对照组比较，病毒对照组有显著差异(P＜0.05)；与病毒对照组比较，1号药组、病毒唑组分泌IL-2显著提高(P＜0.05)，此两组之间亦有显著差异(P＜0.05)。各组小鼠分泌IL-12值均有下降趋势，与病毒对照组比较，1号药组、病毒唑组有显著差异(P＜0.05)，此两组之间无显著差异(P＞0.05)。 ③1号药量效关系研究表明： 一般状态：正常对照组动物状态最好，以后依次是病毒唑组，1号药不同剂量组基本相同，病毒对照组状态最差。 肺指数：与正常对照组相比，病毒对照组小鼠肺指数明显增加(P＜0.05)，说明小鼠感染流感病毒后肺肿大明显。1号药不同剂量与病毒唑组对小鼠感染流感病毒后肺肿大均有抑制作用，组间无明显差异，P＞0.05。 肺组织外观：同配伍实验研究结果相同，中药不同剂量各组间无明显异常。 肺病理：正常组与病毒对照组肺组织病理改变与配伍实验研究结果相同。各组小鼠肺病变程度，正常对照组肺病理无改变。与病毒感染模型组相比，1号药不同剂量对肺脏大体病变、组织病理学方面无显著差异。病毒对照组病理变化最重，病毒唑组改变最轻。 RT-PCR检测病毒核酸，正常组未检测出流感病毒核酸，中药各组与病毒唑组表达水平下降，说明药物具有抑制病毒复制作用，1号药不同剂量组间比较无显著差异(P＞0.05)，中药各组与病毒唑组比较亦无显著差异(P＞0.05)，说明中药具有与病毒唑相近的抗流感病毒作用。同法检测各组小鼠肺组织均有IFN-γmRNA表达，正常对照组有少量表达，其余各组均有所增高。与病毒对照组比较，中药各组与病毒唑组有显著差异(P＜0.05)；与病毒唑组比较，1号药各剂量组无显著差异(P＞0.05)。 ELISA法检测肺组织细胞因子含量：1号药不同剂量与病毒唑均可促进IL-2分泌，与病毒唑组比较，1号药不同剂量组有显著差异(P＜0.05)，病毒对照组IL-2含量明显下降，与之相比，各药物治疗组有显著差异(P＜0.05)。1号药不同剂量与病毒唑均可促进IL-12分泌，与病毒唑组比较，1号药低剂量组、中剂量组无显著差异(P＞0.05)，病毒对照组含量明显下降，与各药物治疗组比较有显著差异(P＜0.05)。 免疫组化：检测各组小鼠的IFN-γ表达，正常对照组平均灰度值低，说明有少量IFN-γ蛋白表达，其余各组阳性目标平均灰度值均增加，与病毒对照组相比，1号药不同剂量和病毒唑组阳性目标平均灰度值增加，中药各组与病毒唑组比较无显著差异(P＜0.05)。正常对照组有少量IL-4分泌，病毒对照组表达明显增加(P＞0.05)。与病毒对照组比较，1号药不同剂量和病毒唑组可抑制IL-4表达，中药各组与病毒唑组比较有显著差异(P＜0.05)，中药各组间无显著差异(P＞0.05)。 结论： 银翘散中主要药物金银花、连翘、牛蒡子及其配伍具有较好的抗流感病毒作用，其机制可能是： 1．抑制病毒复制，减轻免疫损伤：降低肺指数，抑制流感病毒在小鼠肺部的复制，减轻了病毒对肺组织的直接损伤； 2．增强抗感染细胞免疫：通过调控和T淋巴细胞亚群Th1细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-12，Th2亚群细胞因子IL-4的分泌，发挥免疫调节作用，提高细胞免疫应答水平，增强抗病毒能力。 本实验证明中药应用剂量与疗效无相关性。因此我们得出结论，银翘散具有抗流感病毒、调节免疫失衡作用，对增强抗病毒细胞免疫发挥一定作用。