植物源杀虫物质鬼臼毒素的酶免疫分析及环境安全性研究

砂地柏(Sabina vulgaris Ant.)中杀虫活性物质对昆虫表现出多种作用方式,如胃毒、拒食、熏蒸、抑制生长发育及抑制种群形成等,其主要杀虫活性成分鬼臼毒素对多种害虫表现出生物活性,且作用方式多样、作用机理特殊。西北农林科技大学无公害农药研究服务中心,在对杀虫植物砂地柏进行系统研究的基础上,研制开发出新型植物源杀虫剂--0.75%鬼臼毒素乳油。本文以鬼臼毒素制品为研究对象,在对砂地柏杀虫活性物质鬼臼毒素分析方法研究的基础上,对其环境行为和环境安全性等进行了系统研究,得到如下主要研究结果:　 1. 采用不同的路线成功地合成了鬼臼毒素的人工抗原。通过2 种不同路线成功地合成了半抗原4-O(单) 琥珀酰鬼臼毒素;利用混合酸酐法(MAR)和碳二亚胺法(EDC)对半抗原与载体蛋白进行偶联,紫外扫描和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证明成功地合成了免疫和包被所需的人工抗原。人工抗原的偶联比因载体蛋白和合成方法的不同而有所不同,Hapten-BSA1(MAR法)是88.6,Hapten-BSA2(EDC 法)是40.3,Hapten-OVA1(EDC 法)是17.8,和Hapten-OVA2(MAR 法)是54.2。 2. 分别以Hapten-BSA1 和Hapten-BSA2 作为免疫原免疫新西兰大白兔,获得了两套抗鬼臼毒素的特异性抗体,并成功地建立了基于多克隆抗体的鬼臼毒素酶免疫分析技术。以混合酸酐法合成的Hapten-BSA1 作为免疫原,得效价为1/256,000 的血清M4440;以碳二亚胺法合成的Hapten-BSA2 作为免疫原,得效价为1/56,000 的血清M4469。经方阵点滴和间接非竞争ELISA 确定了血清M4440 和M4469 的工作浓度,抗血清M4440的ELISA的工作浓度:包被原稀释度为1/4,000(Hapten-OVA1,0.26μg/mL),血清稀释度为1/15,000;抗血清M4469 的ELISA的工作浓度:包被原为1/1,500(Hapten-OVA2,1.43 μg/mL),血清为1/9,000。用血清M4440 建立的IC-ELISA,对鬼臼毒素的半数抑制浓度(IC50)为2.2136 μg /mL,最低检测浓度为0.1209 μg/mL,检测范围为0.2501-19.5942 μg/mL。用血清M4469 建立的IC-ELISA,对鬼臼毒素的半数抑制浓度( IC50)为0.7897 μg/mL,最低检测浓度为0.0056 μg/mL,检测范围为0.0194-32.11670 μg/mL。建立的鬼臼毒素IC-ELISA分析方法与表鬼臼毒素、4-甲基表鬼臼毒素、脱氧鬼臼毒素有一定的交叉反应,与依泊托甙、苦鬼臼毒素、鬼臼毒素酰肼等的交叉反应率低。　 3. 通过对流动相配比、流速、色谱柱等条件进行优化,确定了鬼臼毒素的HPLC分析条件:色谱柱LichrospherC18, dp5μm, 4.6mmID*25cm;流动相甲醇:水(65: 35,V/V);流速1.0mL/min;进样量5μL;检测波长290nm;鬼臼毒素的保留时间在5.7min。在蒸馏水和土壤中进行添加回收试验,添加浓度在0.1-10μg/mL 间,测得其回收率分别在