传统中药淫羊藿由于其丰富的药用植物资源、多样的药理作用和确切的临床疗效而备受关注,一直是国内外研究的热点。为了更好地开发利用这一资源,我们设计并开展了以下实验:
(1)以小鼠骨髓基质细胞为模型,采用四甲基偶氮唑蓝法、碱性磷酸酶比活性测定方法,在细胞水平筛查了淫羊藿抗骨质疏松的有效极性部位;
(2)利用硅胶和凝胶柱层析分离淫羊藿有效部位中的单体成分,根据化合物光谱数据(ESI-MS,1HNMR和13CNMR)鉴定其结构;
(3)以小鼠骨髓基质细胞为模型,采用四甲基偶氮唑蓝法、碱性磷酸酶比活性测定、茜素红染色及定量测定和油红O染色及定量测定等方法,在细胞水平研究了淫羊藿有效部位和其中分离出的主要单体淫羊藿苷,以及淫羊藿苷代谢产物宝藿苷Ⅰ对小鼠骨髓基质细胞增殖、成骨和成脂分化的影响;
(4)以小鼠成骨细胞为模型,采用四甲基偶氮唑蓝法、油红O染色及定量测定等方法,在细胞水平研究了淫羊藿有效部位、淫羊藿苷及宝藿苷Ⅰ对小鼠成骨细胞增殖及横向分化的影响;
(5)采用蛋白印迹和荧光定量PCR等方法,在分子水平对淫羊藿苷在骨髓基质细胞成骨和成脂分化途径中可能的作用靶点和作用途径进行了研究;
(6)采用MTT法和DPPH法测定6个淫羊藿黄酮对前破骨细胞株RAW264.7增殖的影响以及它们的细胞毒性和抗氧化清除自由基的能力。
研究结果表明:
(1)淫羊藿促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化的有效部位是乙酸乙酯萃取部位和水提物;
(2)从淫羊藿药材乙酸乙酯萃取部位中分离鉴定的6个黄酮类成分,分别为淫羊藿苷(Ⅰ),宝藿苷Ⅱ(Ⅱ),朝藿素B(Ⅲ),宝藿苷Ⅰ(Ⅳ),金丝桃苷(Ⅴ)和木犀草素(Ⅵ);
(3)细胞水平上淫羊藿乙酸乙酯萃取部位可以促进小鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化而不抑制其向脂肪细胞分化。乙酸乙酯萃取物中主要成分淫羊藿苷及其代谢产物宝藿苷Ⅰ,在一定浓度范围内,可以促进小鼠骨髓基质细胞成骨分化并抑制其成脂分化,此作用与化合物结构、浓度及作用时间均有关,尤以10-9和10-88mol/L的淫羊藿苷在第14d的效果最好;
(4)细胞水平上,在一定浓度范围内,乙酸乙酯萃取部位、淫羊藿苷及宝藿苷Ⅰ可以抑制小鼠成骨细胞向脂肪细胞的横向分化,以10-9和10-8mol/L的淫羊藿苷在第6d的效果最好:
(5)淫羊藿苷可能通过对ERα蛋白表达的作用影响小鼠骨髓基质细胞成骨分化和成脂分化。
以上结果说明淫羊藿苷作为淫羊藿抗骨质疏松的有效成分,在合适的浓度和作用时间下,可以双向调节骨髓基质细胞的成骨和成脂分化,同时抑制成骨细胞的成脂横向分化:一方面通过增加成骨细胞的数量而直接促进骨形成,另一方面通过减少脂肪细胞的数量而间接促进骨髓基质细胞成骨分化并降低脂肪细胞对破骨细胞的促进作用,从而在整体水平上使骨量增加,达到防治骨质疏松的作用,而ERα则是淫羊藿苷发挥作用的可能靶点之一。
(6)另外,其他生物活性筛查实验表明:淫羊藿黄酮类化合物对前体破骨细胞株RAW264.7细胞的生长是促进还是抑制依赖于其自身的化学结构以及作用浓度。通过抑制前体破骨细胞的增殖,进而抑制前体破骨细胞分化形成破骨细胞,可能是淫羊藿发挥抗骨质疏松作用的机理之一;同时,淫羊藿抗肿瘤的作用可能部分通过黄酮抗氧化机理产生。这些为淫羊藿其他方面的开发利用提供了一些数据。