植物提取物防护H2O2诱导人皮肤细胞损伤的研究

人皮肤的过早老化，主要是由于环境因素引起的皮肤损伤作用积累的结果，其中过度氧化是引起细胞损伤与凋亡的重要因素之一。人皮肤成纤维细胞是人的皮肤真皮中的主体细胞成分，具有特定的生物学特性，与人皮肤的老化息息相关。本论文建立了人皮肤成纤维细胞氧化损伤及凋亡模型，探讨了植物及中草药提取物对过氧化氢诱导人皮肤成纤维细胞损伤和细胞凋亡的防护作用，并对其防护作用的机理进行了初步研究。主要结果及结论如下： （1）用过氧化氢作为氧化剂，诱导人皮肤成纤维细胞损伤或凋亡。采用MTT法，观察过氧化氢对成纤维细胞存活的影响；用hoechst染色、PI染色以及原位末端标记法检测过氧化氢引起成纤维细胞的凋亡作用，结果表明：过氧化氢能够引起人皮肤成纤维细胞的损伤，产生细胞凋亡甚至死亡。根据细胞半数存活率，以及凋亡情况，最后确定的诱导条件为：用0.8mM过氧化氢诱导6h。 （2）利用膜片钳技术结合钾离子通道兴奋和抑制剂，探索过氧化氢调节钾离子通道机制。结果表明人的皮肤成纤维细胞存在多种不同类型的电压依赖性离子通道，包括A型瞬时外向钾离子通道（IA）以及慢失活外向钾离子电流，其中慢失活外向钾离子电流又包括：外向延迟整流钾离子电流（IK）及钙激活钾离子电流(IK （Ca）)。过氧化氢很大程度上改变了电压门控外向慢失活钾离子通道的稳态激活。PKC特异性抑制剂-bisindolylmaleimide （Bis）能够大大降低过氧化氢所引起的钾离子电流幅度的增加。PMA引起的PKC信号通道的激活可以模仿过氧化氢诱导引起的钾离子电流增强。大电导钙激活钾离子通道（BK）是主要的钙激活钾离子通道，属于电压门控外向钾离子通道的一种，结果发现BK通道特异性阻断剂iberiotoxin （IBTX）和Paxilline，能够阻断钾离子通道，并且抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡。结果表明，过氧化氢引起的人皮肤成纤维细胞凋亡时通过PKC信号传导系统，改变人皮肤成纤维细胞电压门控外向钾离子通道电流，主要是BK通道，引起细胞凋亡。 （3）为验证抗氧化剂在本文建立的人皮肤成纤维细胞氧化损伤和凋亡平台上的防护作用与机制，选择一种经大量研究证明具有抗氧化性的物质EGCG，利用上述过氧化氢诱导人体成纤维细胞损伤及凋亡模型进行一系列实验，进一步证实其对细胞氧化损伤及凋亡的防护作用；本文还深入研究其机制，研究结果显示：通过测定EGCG的抗氧化能力，得到200μg/mL EGCG的自由基清除率能够达到91.42%。在过氧化氢诱导人皮肤成纤维细胞凋亡损伤及凋亡模型中，使用不同浓度的EGCG （0,10,20,50,100及200μg/mL）可以提高过氧化氢引起细胞损伤的存活率，其中20μg/mL,50μg/mL及100μg/mL处理组有显著性差异（P <0.05），50μg/mL组的作用尤为明显。采用TUNEL方法验证，50μg/mLEGCG组与仅用H2O2处理组的细胞凋亡数具有显著差异，凋亡率由38.12%降低为28.05%。机制研究表明，EGCG能够有效逆转过氧化氢引起的人皮肤成纤维细胞抗氧化酶SOD降低、MDA升高以及GSH-px降低。结果表明，抗氧剂EGCG能够通过清除氧自由基、平衡细胞氧化还原体系，拮抗和防护氧化损伤引起的细胞损伤和凋亡。同时这些结果为下一步植物提取物防护细胞损伤研究提供了阳性对照物。 （4）本文重点研究了用酶法从燕麦麸中分离纯化得到小分子量的含糖的多肽，并应用中医组方理论获得的三种中草药复方提取物，及其对细胞损伤的防护作用及机理。同样首先验证了它们的抗氧化能力，0.5mg/mL燕麦多肽及三种中草药复方提取物的自由基清除率可分别达29%,36.7%,42.87%及40.54%。在过氧化氢诱导之前先用燕麦多肽孵育人皮肤成纤维细胞3h,6h及12h，然后再加入0.8mM过氧化氢孵育6h，结果显示燕麦多肽不能有效地防护过氧化氢所引起的细胞氧化损伤，将其提前孵育的时间增加至24h时，检测结果显示0.1mg/mL,浓度的燕麦多肽能显著对抗过氧化氢诱导的细胞损伤的影响。三种中草药复方提取物的研究结果与燕麦多肽结果十分的相似。即需要事先与细胞孵育24h后，并与H2O2同时存在时，此时的处理组对过氧化氢诱导的细胞损伤的防护作用具有显著性（P <0.05）。用1mg/mL燕麦多肽提前孵育24h，细胞凋亡率从14.5%降至8.9%，并具有显著性差异；三种中草药复方提取物中，提取物2及提取物3与H2O2处理组相比也均有显著的差异（P <0.05）。燕麦多肽能够逆转过氧化氢引起的人皮肤成纤维细胞SOD降低、MDA升高。由于植物及中草药提取物成份的复杂性，在抗氧化、避免氧化剂诱导细胞损伤或凋亡机制方面存在差异。推测其防护机制可能是在细胞体内产生调节SOD、GSH-px等抗氧化酶合成增加或活性增强。 这些研究结果丰富了皮肤细胞凋亡的理论与机制，为抗氧化物质的筛选与机理研究，提供了一个很好的研究平台，具有一定的理论和应用价值。本论文筛选出的植物提取物对防护人皮肤成纤维细胞氧化损伤和凋亡的结果，为在抗氧化、抗衰老保健品及个人防护用品的应用提供了科学依据和应用前景。