骨形态发生蛋白7衍生多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料修复骨缺损的实验研究

第一章新型骨形态发生蛋白7衍生多肽对骨髓基质干细胞生物学行为的影响 目的：观察采用FMOC/tBu固相多肽合成法人工合成的新型骨形态发生蛋白7衍生多肽对骨髓基质干细胞生物学行为的影响,包括增殖、成骨分化及矿化。 方法：骨形态发生蛋白7衍生多肽采用FMOC/tBu固相多肽合成法合成。大鼠骨髓基质干细胞通过原代分离培养获得,并用流式细胞仪鉴定其表面标志物CD90,CD34。将传至第3代的骨髓基质干细胞分为实验组和对照组,在实验组细胞培养基加入终质量浓度为100mg/L的骨形态发生蛋白7衍生多肽,对照组中不添加多肽。经过2,4,6,8,10d时间的培养后,对各组细胞进行MTT检测,评价骨髓基质干细胞的增殖情况；对各组细胞进行7,14,21d的培养后,采用细胞内钙含量法和碱性磷酸酶法评价各组细胞的活性及其成骨分化情况,并通过钙黄绿素染色观察各组细胞的矿化情况。 结果：经FMOC/tBu固相多肽合成法和高效液相色谱法可获得纯纯度为97%的骨形态发生蛋白7衍生多肽(KQLNAISVLYFDD)。原代培养大鼠骨髓基质干细胞生长良好,通过流式细胞仪检测其细胞表面标志CD90和CD34,阳性率分别达到91.5%和1.23%。MTT检测结果表明实验组和对照组中的骨髓基质干细胞在中均增殖良好,差异无统计学意义(P>0.05)；经过7d,14d和21d的诱导培养后,实验组骨髓基质干细胞的碱性磷酸酶活性及钙含量显著高于对照组(P<0.05),实验组细胞钙黄绿素染色阳性率明显强于对照组。 结论：FMOC/tBu固相多肽合成法可以成功合成骨形态发生蛋白7衍生多肽,该活性多肽对骨髓基质干细胞的增殖没有显著影响,但是可以促进骨髓基质干细胞的成骨分化和矿化。 第二章骨形态发生蛋白7衍生多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原材料的制备及其与骨髓基质干细胞相容性研究 目的：制备新型复合材料骨形态发生蛋白7衍生多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原,通过体外与骨髓间充质干细胞复合培养,观察其对骨髓间充质干细胞黏附、增殖及分化的影响。 方法：采用共沉淀法制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原新型复合支架材料,通过扫描电镜观察该复合支架材料表面的微观形貌；将骨形态发生蛋白7衍生多肽通过真空吸附与支架材料复合,通过高效液相色谱仪检测骨形态发生蛋白7衍生多肽在体外的释放规律；通过将复合骨形态发生蛋白7衍生多肽的支架材料与骨髓间充质干细胞复合培养,以未复合多肽的支架材料作为对照,观察骨髓间充质干细胞在支架材料表面黏附率、增殖、生长以及碱性磷酸酶活性等情况。 结果：扫描电镜结果显示新型复合支架材料壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原支架材料呈多孔状,孔径约为10～100μm不等；该复合支架材料与骨形态发生蛋白7衍生多肽复合后,活性多肽可以从支架材料中缓慢释放,其释放规律为：骨形态发生蛋白7衍生多肽的释放量在第1天时约占总量的(32.5±1.22)%,呈爆发性释放,之后呈缓慢持续释放至14d,其累积释放量约占总量的(64.02±4.21)%；骨髓间充质干细胞在复合多肽的支架材料表面的黏附及成骨分化能力均明显强于对照组(P<0.05),其增殖能力与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。 结论：骨形态发生蛋白7衍生多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原新型复合支架材料细胞相容性良好,是一种理想的骨组织工程支架材料。 第三章骨形态发生蛋白7衍生多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料促进骨再生的实验研究 目的：观察骨形态发生蛋白7衍生多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原新型复合支架材料对大鼠颅骨缺损再生的促进作用。 方法：采用共沉淀法制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原新型复合支架材料,通过扫描电镜观察该复合支架材料表面的微观形貌；将骨形态发生蛋白7衍生多肽通过真空吸附与支架材料复合；取成年SD大鼠24只随机分成两组,分别在大鼠顶骨左、右两侧制备极限缺损,右侧为实验组植入骨形态发生蛋白7衍生多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合支架材料,左侧设为对照组植入单纯壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合支架材料,将各组大鼠分别于6周和12周两个时间点分批处死,对标本进行大体观察、组织学观察、CT三维重建、Masson染色和生物力学测试等检测。 结果：本研究制备的壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原支架材料经扫描电镜检查结果显示其形貌呈多孔状。动物实验的结果显示：实验组在术后6周,大体观察可见植入材料与骨缺损边缘界限模糊,连接紧密,植入区质地较硬,CT三维重建可见缺损区有部分高密度影呈片状,密度与正常骨组织相似,HE染色显示实验组新骨形成面积百分比为33.32±7.32%；对照组在术后6周,大体观察可见植入材料与骨缺损边缘界限明显,CT三维重建可见缺损区仅有轻微的片状致密影,比正常骨密度低,HE染色结果显示对照组新骨形成面积百分比为18.05±3.19%,与实验组相比差异有统计学意义(P<0.05)。实验组在术后12周,大体观察结果显示材料已基本被再生的骨代替,质地坚硬；CT三维重建结果显示骨缺损完全愈合,HE染色结果显示新骨形成面积百分比为91.26±9.46%,对照组在术后12周,大体观察结果显示植入材料与骨缺损边缘界限明显；CT三维重建可见高密度影面积增大接近缺损面积的1/2,HE染色结果显示新骨形成面积百分比为51.54±5.01%,与实验组相比差异有统计学意义(P<0.05)。术后12周,实验组和对照组进行Masson三染,结果显示实验组材料大部分降解,被大量被染为红色的成熟板层骨所代替,而对照组植入材料仅部分降解,期间散在少量被染为绿色的新生编织骨。术后12周,生物力学测试显示：两项指标最大压力载荷和载荷/应变比值实验组均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而最大应变位移对照组高于实验组,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论：新型复合支架材料骨形态蛋白7衍生多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原能有效促进骨缺损修复,是一种具有良好应用前景的骨修复材料。