Lupeol对肝细胞肝癌的抑制作用及其机制研究

第一章lupeol诱导肝细胞肝癌细胞凋亡并抑制体内肿瘤生长 目的:研究lupeol体内外抗肝癌作用,从整体、细胞、分子水平探讨其作用机制;研究其与rTrail联合抗肝癌作用。 方法:（1）采用MTT法研究luepol体外对HCC细胞系细胞增殖的抑制作用,采用人HCC细胞系SMMC7721细胞移植肿瘤裸鼠模型研究lupeol对体内肿瘤生长的抑制作用;（2）采用倒置显微镜、流式细胞术从形态学水平和生化角度检测lupeol对HCC细胞凋亡的诱导和细胞周期的影响,采用western blot方法分析其诱导凋亡的机制;（3）采用倒置显微镜观察和流式细胞术从形态学水平和生化角度检测lupeol与rTRAIL联合对HCC细胞凋亡的诱导和细胞周期的影响,确定其联合作用是否为协同作用。 结果:（1）体外抑瘤结果显示,lupeol能显著抑制人HCC细胞增殖,并且具有量效关系,作用48h的IC50为40μmol/L -50μmol/L;体内模型抑瘤试验结果显示,lupeol能显著抑制人HCC细胞系SMMC7721细胞移植肿瘤的生长;（2）形态学倒置显微镜观察和流式细胞术结果显示,lupeol能诱导HCC细胞凋亡,阻滞细胞周期进程;western blot结果显示lupeol作用后使促凋亡蛋白caspase-3、cleaved-PARP活化上调,诱导胞内凋亡信号转导;（3）形态学倒置显微镜观察和流式细胞术结果显示,lupeol与rTRAIL联合能抑制HCC细胞增殖,诱导HCC细胞凋亡,但其作用只具有累加性,不具有协同性。 结论:lupeol在体外能诱导HCC细胞凋亡,并能抑制体内肿瘤生长;但其与rTrail联合,只是具有相加作用,不具有协同性。 第二章Lupeol与PI3K抑制剂S14161具有协同抗肝癌作用 目的:研究提高lupeol抗肝癌治疗效果的方法;从细胞、基因、蛋白水平探讨低浓度lupeol促进肿瘤生长的作用机制,通过联合PI3K信号通路抑制剂,来协同提高lupeol抗肝癌治疗效果。 方法:（1）对lupeol化学结构进行改造,采用MTT方法比较lupeol及其化学结构改造后衍生物对HCC细胞系细胞增殖的抑制作用;（2）采用MTT方法、流式细胞术方法对比lupeol及其衍生物H2在低浓度区间对HCC细胞增殖的抑制作用、对细胞凋亡的诱导作用,并采用RT-PCR、western blot方法研究其分子机制;（3）采用MTT方法检测PI3K抑制剂S14161对HCC细胞增殖的抑制作用,选择合适浓度,联合低浓度lupeol,采用MTT方法检测联合用药对HCC细胞增殖的抑制作用,并采用western blot方法研究其分子机制;（4）采用SMMC7721细胞移植肿瘤裸鼠模型,研究lupeol联合S14161对体内肿瘤生长的抑制作用。 结果:（1） MTT结果显示,lupeol衍生物H1、T1、T2对HCC细胞增殖的抑制作用低于lupeol, lupeol对HCC细胞作用的IC50为40μmol/L-50μmol/L,H1、T1、T2作用的IC50分别为大于120μmol/L、大约50μmol/L、70μmol/L-80μmol/L;而衍生物H2对HCC细胞增殖的抑制作用优于lupeol,IC50小于30μmol/L;（2）流式细胞术、RT-PCR、western blot结果显示,低浓度lupeol不能诱导HCC细胞凋亡,对胞内促凋亡分子及PI3K/Akt信号通路关键分子的表达水平作用微小,而低浓度H2能诱导HCC细胞凋亡,使胞内促凋亡分子表达上调及PI3K/Akt信号通路关键分子表达下调;（3） MTT结果显示,S14161对HCC细胞作用的IC50大约为4μmol/L,选取1μmol/L和3μmol/L两个浓度,进行与lupeol的联合用药试验;MTT结果显示,lupeol与1μmol/L和3μmol/L S14161联合,协同促进了对HCC细胞增殖的抑制作用,低浓度区间更为明显;（4） western blot结果显示,lupeol 20μmol/L联合S14161 1μmol/L和3μmol/L,协同下调了HCC胞内PI3K/Akt信号通路的转导;（5）肿瘤移植裸鼠模型体内联合用药结果显示,lupeol与S14161协同抑制了体内肿瘤的生长。 结论:低浓度lupeol促进肿瘤生长是由于激活了PI3K/Akt通路。Lupeol和S14161单独应用对HCC细胞增殖均有抑制作用,低剂量联合有协同作用,联合用药提高了抗肝癌活性且无毒副作用。因而lupeol联合PI3K信号通路抑制剂可能是更安全有效的抗肿瘤候选药物,值得进一步研发。 第三章慢性乙型肝炎患者外周血CD4+T细胞中可检测到IL-35的表达 目的:检测慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血CD4+T细胞中是否有IL-35的表达,为CHB发病机制的研究和临床治疗提供理论依据。 方法:从CHB患者和健康人外周血中分离纯化CD4+T细胞,抽提总RNA和总蛋白,通过RT-PCR和免疫共沉淀（IP）&western blot方法,检测IL-35 mRNA水平和蛋白水平的表达。 结果: RT-PCR结果显示,纯化的CHB患者外周血CD4+T细胞中可检测到IL-35 mRNA的表达;IP&western blot结果显示,纯化的CHB患者外周血CD4+T细胞中可检测到IL-35蛋白的表达。而健康人检测不到。 结论: CHB患者外周血CD4+T细胞中IL-35的表达可能参与抑制机体抗HBV特异性免疫反应,更好的阐明了CHB的发病机制。IL-35可能成为CHB临床治疗新的靶分子。