消癌解毒方中白花蛇舌草抑制结肠癌的作用及机制研究

目的：国医大师周仲瑛教授基于癌毒理论总结的消癌解毒方在临床中已证实其卓越的疗效,周教授基于癌毒理论治疗各组肿瘤最常用的君药为白花蛇舌草,其在各肿瘤组方中使用频率高达74%,尤其在消化系统肿瘤如结肠癌中,白花蛇舌草更是一直居于周仲瑛教授抗癌组方最重要的地位。中药抗癌虽然在结肠癌治疗中居于较重要地位,但即使像白花蛇舌草这样一味抗癌超级明星中药,其在抑制肿瘤生长中的作用及机制仍不清楚,本研究拟探讨白花蛇舌草抗结肠癌的作用及其分子机制。方法：结肠癌HCT-116、Lovo、HT-29和DLD-1细胞购自中国医学科学院细胞库,结肠癌原代细胞来自无锡市人民医院手术切除标本。细胞培养于并维持在RPMI/DMEM培养基中,加入10%的FBS,青霉素/链霉素(1:100, Sigma),培养在37℃ CO2培养箱中,取对数生长期细胞用于实验。细胞给予白花蛇舌草浓度(Ctrl、10、25、50、 200μg/ml)和指定的时间(0、6h、24h、48h、72h、96h),显微镜下观察细胞形态,运用MTT方法检测细胞存活率,同时对细胞进行台盼蓝染色,计算活细胞率；运用组蛋白DNA-ELISA及Annexin V试剂盒检测细胞凋亡,LDH分析法检测细胞死亡率,线粒体免疫共沉淀分离线粒体,Western blot检测总的和磷酸化的AMPKα1、ACC、Caspase-3、 Bcl-2、HIF-la, S6K、p53信号通路的改变,运用程序性死亡抑制剂及凋亡抑制剂进一步验证白花蛇舌草诱导细胞死亡方式。建立p53-shRNA、AMPKα1-shRNA及AMPK-α1显性失活(DN)突变(DN-AMPK-α1) cDNA稳转的结肠癌细胞,运用上述方法进一步验证信号通路的改变。同时检测生长因子受体包括EGFR、PDGFRa、PDGFRβ和FSCN1的表达,运用上述方法验证其体外活性,建立裸鼠模型,给予一定浓度白花蛇舌草,记录裸鼠存活率、肿瘤大小,免疫组化检测组织AMPKα1表达,Western blot检测总的和磷酸化的AMPKα1、ACC、Caspase-3、Bcl-2、HIF-1a, S6K、p53信号通路的改变,进一步验证白花蛇舌草抗结肠癌作用的分子机制。结果：白花蛇舌草对HCT-116、Lovo、HT-29和DLD-1及原代结肠癌细胞均有抑制细胞活力、导致死亡、诱导细胞凋亡的作用。运用Caspase-3特异性抑制剂显著降低白花蛇舌草导致的HCT-116结肠癌细胞死亡,差异有统计学意义(P<0.05),表明Caspase-3介导了白花蛇舌草诱导的结肠癌细胞凋亡。通过LDH释放的增加,检测白花蛇舌草诱导的HCT-116细胞坏死,表明白花蛇舌草的细胞毒性对结肠癌细胞表现为细胞的凋亡。进一步的机制研究表明,白花蛇舌草作用于结肠癌细胞,可活化AMPK,抑制]mTORC1的活性,并下调下游Bcl-2和HIF-1α基因表达。通过抑制MPKα1活性,mTORC1抑制释放,Bc1-2和HIF-1α表达又增加。同时,本研究还发现白花蛇舌草活化AMPK后,导致p53磷酸化激活,以引发细胞程序性坏死。并且,AMPK活化后又促进生长因子受体EGFR、PDGFR和FSCN1的降解。结论：白花蛇舌草对HCT-116、Lovo、HT-29和DLD-1及原代结肠癌细胞均有抑制细胞活力、导致死亡、诱导细胞凋亡的作用。AMPK活化可能介导白花蛇舌草诱导的结肠癌细胞凋亡,具体机制可能与mTORC1抑制、p53活化及EGFR、PDGFR和FSCN1等癌基因的降解有关。