丹参中迷迭香酸生物合成途径的苯丙氨酸支路基因的克隆及研究

迷迭香酸（Rosmarinic acid）是生药丹参（Salvia miltiorrhiza Bung. ）的重要水溶性活性成分之一,具有抗炎、抗菌、抗氧化等生理活性。随着丹参药材临床使用的不断扩大,市场对丹参药材的需求越来越大。从上世纪70年代开始,人们开始尝试采用不同的方法提高目标次生代谢产物的含量,开展生物合成代谢研究是提高次生代谢物的有效成分的方法之一。近年来对迷迭香酸生物合成途径的研究表明,该生物合成途径包括两条平行的苯丙氨酸支路和酪氨酸支路,包括几步酶促反应,两条支路的产物4-香豆酰Co-A和3,4-二羟基苯乳酸在迷迭香酸合成酶（RAS）的作用下生成迷迭香酸。在丹参中迷迭香酸生物合成途径并未得到最终证实。不少植物中迷迭香酸的生物合成酶已经被分离克隆,而丹参中该途径的基因很少有研究。 本研究采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends RACE）技术,首次成功的从丹参嫩叶中分离克隆出丹参迷迭香酸生物合成途径中苯丙氨酸支路上的肉桂酸-4-羟化酶SmC4H（cinnamate-4-hydroxylase）的全长cDNA序列和基因组DNA序列以及苯丙氨酸解氨酶SmPAL（phenylalanine ammonia-lyase）的全长cDNA序列。对各基因的研究如下: 1、SmC4H基因:根据其他物种中的C4H的序列,选择保守区域设计特异性引物克隆出丹参的SmC4H的全长cDNA序列及基因组DNA序列。两者之间的序列比对结果表明,该基因含有三个外显子和两个内含子。该cDNA序列全长1800 bp,包含一个完整的1512 bp的开放阅读框（Open Reading Frame）,编码504个氨基酸组成的前体蛋白。对该基因进行的氨基酸水平的比对表明,该基因与藿香的C4H相似性达到94.7%,一致性达到89.7%。一步法RT-PCR分析内源植物激素信号分子及外界刺激对SmC4H表达量的影响情况表明:脱落酸（ABA）、甲基茉莉酸（MeJA）和紫外照射（UV-B）处理与对照组相比,均上调SmC4H转录水平的的表达,其中以UV-B的影响最大,而氯化钙（CaCl2）和双氧水（H2O2）的处理对SmC4H的表达无影响。RT-PCR分析该基因在根、茎和叶中的表达量的结果表明:该基因在根、茎和叶均中有表达,在根和茎中的表达水平较高,在叶中的表达较低。