目的:各种慢性肾脏病进行性发展的共同结局是终末期肾病(end stage renal disease,ESRD),ESRD已成为严重威胁人类健康的常见病,目前的肾脏替代治疗虽然获得了长足的进步,但是ESRD仍有较高的死亡率,其治疗费用已成为严重的社会负担。如何早期发现慢性肾脏病(Chronic kidney diseases CKD)并采取有效措施延缓其进展至ESRD,已成为人类面临的严峻挑战。CKD慢性进展的实质是肾脏纤维化,研究已经证实它与肾脏产生的多种细胞因子、生长因子的作用有关,然而临床上尚缺乏早期、动态监测肾脏纤维化进程的有效方法。既往研究表明尿液中细胞因子的水平与CKD的发生、发展有着十分密切的联系,但能否应用尿液中的细胞因子变化谱来动态监测CKD进程仍然是肾病工作者亟需探讨的问题。蛋白组学时代的到来以及相关技术的出现,为我们探讨此问题提供了崭新的技术平台。本研究应用一种全新的蛋白组学技术——抗体芯片(antibody array)技术检测CKD患者尿液中细胞因子的变化并探讨其临床意义。
材料与方法:选择7例CKD患者,全部符合美国肾脏病基金会K/DOQI指南中慢性肾脏病的诊断标准,并且有明确的肾脏病理诊断。应用MDRD公式计算GFR水平,并依据GFR水平,将7例患者分为两组:Ⅰ组:GFR≥80ml/min/1.73m2共4例;Ⅱ组:GFR≤40 ml/min/1.73m2共3例。另外,选取3名性别、年龄相匹配的健康志愿者作为正常对照。应用Raybiotech人类细胞因子抗体芯片,依据试剂盒中操作手册进行操作,同时检测各组尿液中细胞因子水平。在此基础之上,选取2种有表达差异的细胞因子,应用经典的ELISA方法进行定量分析,以验证细胞因子抗体芯片技术的可靠性。
结果:与正常对照组相比,共有15种因子的水平发生了显著变化。MCP-1、RANTES、TIMP-1、TNF-α、VEGF、E-selectin、Fas、ICAM-1、IL-2、MMP-2、TGF-β、E-cadhenrin水平同正常对照组相比升高了2-5倍。其中MCP-1、RANTES、TIMP-1、TNF-α和VEGF的水平随着受损程度加重而进一步升高。而VCAM-1和PDGF-BB的水平同正常对照组相比有下降趋势。在芯片所包含的20种细胞因子中MMP-9的水平变化尤其显著,同正常对照组相比,CKDⅠ组表达水平是正常对照组的492.8倍,CKDⅡ组表达水平是正常对照组的198.7倍。为了验证检测结果的可靠性,我们选择了2种在抗体芯片检测过程中有明显差异的细胞因子——MCP-1和TNF-α,然后应用经典的ELISA方法进行检测,并同抗体芯片技术所得结果进行了比较,我们发现两种方法检测结果具有良好的相关性。在检测MCP-1水平时两者的相关系数r值为0.976(p<0.001),在检测TNF-α水平时两者的相关系数r值为0.939(p<0.001)。
结论:抗体芯片技术能够高通量、平行性检测尿液中多种细胞因子的表达水平。抗体芯片所得到的半定量数据能够真实反应尿液细胞因子的水平。抗体芯片检测结果提示CKD患者尿液中细胞因子表达水平同正常对照组有明显差异并且同疾病所处阶段有一定的关系。并初步发现MCP-1、RANTES、TIMP-1、TNF-α和VEGF有可能作为尿液中的生物学标记物来监测CKD进程。抗体芯片技术有可能成为监测慢性肾脏病进展的新型技术平台。
