L选择蛋白介导人单核细胞源性树突状细胞在动脉粥样硬化中的作用

背景：以动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)为基础的心、脑血管疾病是现代社会病死率和致残率最高的疾病，严重降低人们的生活质量，因此针对AS的发生机制，预防和控制AS发生和发展已成为心血管疾病研究领域的热点和难点。近年来先后有学者提出脂质沉积学说，单克隆学说、血小板聚集学说和炎症细胞浸润学说,但均不能解释AS的全过程。Ross于1999年大胆提出AS是一种炎症免疫性疾病，并得到学术界的普遍认可，为动脉粥样硬化的病因研究、预防和治疗带来了革命性影响。 树突状细胞(Dendritic cell, DC)是目前发现的功能最强大的专职性抗原提呈细胞(Antigen presentation cell, APC),是唯一能有效激活初始型T细胞的APC,是机体发生免疫反应的始动者。未成熟DCs的生理功能主要是对抗原的的摄取、加工及较强的迁移能力,但因其细胞表面不具有高水平的MHC II类分子和共刺激分子,只能较弱的激活T细胞。与之相反,成熟DCs能激活初始型T细胞并启动免疫反应。1995年Bobryshev首次发现了树突状细胞存在于正常动脉管壁中，并将这类DCs命名为血管树突状细胞（VDC）。研究发现，在动脉粥样硬化斑块中树突状细胞数量明显多与正常动脉管壁，提示DCs可能参与了动脉粥样硬化的发生和发展。在AS形成的早期，单核细胞的浸润可致血源性的树突状细胞数量增多并被活化，促进其发育为成熟DCs。有学者证实，不稳定斑块中的DCs多于稳定斑块中的DCs，并推测DCs存在于斑块中的数量和部位与斑块的稳定性密切相关。Toll样受体4因其大量存在于DCs表面，并通过信号转导最终导致核因子-κB (NF-κB)和免疫反应基因的激活,引起炎症因子和趋化因子的分泌,介导炎症反应的的发生和发展。 L-选择蛋白是细胞黏附分子选择素家族中的一员,主要参与炎症反应与免疫应答时白细胞的滚动和粘附。研究证实，树突状细胞表面存在L-选择蛋白的主要配体sleX、MadCAM。研究表明，不稳定心绞痛患者其血清中L-选择蛋白较稳定性心绞痛患者和正常人水平明显升高，提示L-选择蛋白介导的细胞粘附和炎症反应与斑块的不稳定性有关。Allan在心肌缺血模型中证实了L-选择蛋白单克隆抗体可使心肌坏死减少60%。因此，我们大胆推测L选择蛋白通过TLR4信号转导通路介导DCs成熟并参与动脉粥样硬化的发生和发展。 目的：在离体细胞水平观察L-选择蛋白对人单核细胞源性树突状细胞分化及免疫功能的影响并进一步探讨其发生机制。 方法：采用健康人外周血经免疫磁珠方法分离出CD14+单核细胞，加入重组人GM-CSF和IL-4细胞因子诱导单核细胞定向分化为DCs。DCs在培养基中孵育5天，收集并随机分为四组。分别为与脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)、L选择蛋白、L选择蛋白抑制剂及不加任何刺激因子的DCs孵育24-36小时,电镜下观察四组DCs形态变化、流式细胞仪检测免疫表型CD1a、CD80、CD83、CD86表达的变化,提取总RNA，采用RT-PCR检测TLR4mRNA；流式细胞仪检测四组TLR4蛋白表达率。 结果：经L选择蛋白刺激后的DCs胞体变大，呈不规则形，细胞表面有很多且长的突起，胞质丰富，胞浆中细胞器较未成熟组少。而未成熟组DCs胞体较小，外形较规则，未见长的突起。与阴性对照即未成熟组相比，L选择蛋白组DCs表面抗原CD1a，CD80，CD83，CD86表达明显增加。而L选择蛋白拮抗剂组即Fucodian组较L选择蛋白组抗原表达量有所下调。L选择蛋白可以上调DCs内TLR4mRNA的表达,流式细胞仪结果示经L选择蛋白干预后的DCs较未成熟组表达TLR4蛋白水平高，且给予L选择蛋白抑制剂可部分下调DCs表面表达TLR4。 结论： L选择蛋白与树突状细胞共培养后能促进树突状细胞成熟并表达高水平的共刺激分子CD1a、CD80、CD83、CD86；RT-PCR结果和流式细胞仪结果显示L选择蛋白能上调TLR4表达，而L选择蛋白拮抗剂能部分下调上述结果。我们推测L选择蛋白与树突状细胞表达的配体相结合后通过TLR4通路促进DCs成熟，促进了动脉粥样硬化的发生和发展。L选择蛋白抑制剂能与L选择蛋白竞争配体，能部分下调上述结果，作用较不完全，还有待于进一步在动物实验和临床试验中检验，同时也给AS的早期治疗提供了一个新视角。