成骨细胞FGF23的表达与局部调节研究

目的： 通过体外培养新生大鼠头盖骨细胞,研究成骨细胞中成纤维细胞生长因子23(Fibroblast growth factor 23,FGF23)表达及钙、磷、甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)和1,25二羟维生素D(1,25(OH)2D3)对其表达的影响；研究FGF23表达水平与成骨细胞分化状态的关系,并从1,25(OH)2D旁分泌／自分泌和细胞接触通讯的角度研究其分化过程中高表达的局部调节机制。 方法： 1.体外分离培养新生大鼠头盖骨细胞,应用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)、茜素红(Alizarin bordeaux staining,ARS)染色等方法进行成骨细胞功能学鉴定。采用RT-PCR和蛋白印记(Western blot)方法检测FGF23在成骨细胞中的表达及钙(5mmol/L氯化钙)、磷(5mmol/L,β甘油磷酸钠,β-GP)、PTH(10-9 mol/L rhPTH(1-34))和1,25(OH)2D3(10-8M)的作用； 2.分别于成骨细胞半汇合、汇合、基质堆积、矿化四个培养阶段获得不同分化状态细胞,通过其ALP、骨钙素(Osteocalcin,OCN)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)的mRNA表达水平变化进行分化状态验证。采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot技术检测其FGF23 mRNA和细胞内FGF23蛋白水平的变化。 3.分别检测成骨细胞于增殖状态(半汇合)和分化状态(汇合阶段)的1α-羟化酶基因CYP2781和24-羟化酶基因CYP24A的mRNA表达水平,并通过la-羟化酶底物25(OH)D3和羟化酶抑制剂酮康唑(Ketoconazole,KET)作用,观察无血清培养条件下成骨细胞内源性1,25(OH)2D对FGF23表达的影响。 4.观察细胞在100μmol／L缝隙连接蛋白抑制剂甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)对成骨细胞汇合前后FGF23表达的影响。 结果： 1.体外培养大鼠成骨细胞中FGF23的mRNA和蛋白表达呈阳性。外源性10-8mol／L1,25(OH)2D3刺激后,成骨细胞FGF23的mRNA表达水平明显上调,约为对照组的16倍(p<0.001),而CaCl2、β-GP、PTH刺激后FGF23 mRNA表达水平与对照组相比差异无统计学意义。 2.体外培养成骨细胞FGF23的表达呈分化阶段性,分化成熟状态(汇合阶段)细胞FGF23表达显著上调,其mRNA为半汇合的增殖状态细胞的7.5倍(p<0.001),蛋白水平为增殖状态细胞的126%。基质堆积和矿化阶段,FGF23mRNA回落至半汇合水平,而其蛋白水平逐渐累及,基质堆积期蛋白水平为增殖时期的207%(p<0.05)。与增殖状态细胞比较,分化状态成骨细胞CYP2781(编码1α羟化酶)和CYP24A(编码24羟化酶)表达上调,其mRNA水平分别为增殖状态的2倍(p<0.05)和34倍(p<0.001),提示内源性1,25(OH)2D功能的增强。 3.无血清培养时,在半汇合和汇合阶段加入100nmol/L25(OH)D3,明显上调成骨细胞FGF23表达,其mRNA水平分别为对照组的16倍(p<0.001)和28倍(p<0.001)。对汇合阶段细胞的刺激作用强于半汇合阶段。同时CYP2781表达增加(p<0.05),CYP24A表达显著增加,汇合前和汇合状态成骨细胞CYP24AmRNA水平分别为对照组的1700倍(p<0.001)和800倍(p<0.001)。10nmol／L羟化酶抑制剂KET可有效阻断该底物的刺激作用。 4.100μmol／L甘珀酸明显抑制无血清培养中汇合阶段成骨细胞FGF23表达,其mRNA水平较PBS对照组减少38%(p<0.05),半汇合阶段细胞的抑制作用不明显。 结论： 1.外源性1,25(OH)2D能强烈刺激体外培养成骨细胞FGF23的表达。 2.生理状态下FGF23的表达与成骨细胞的分化状态有关,分化成熟过程成骨细胞FGF23表达上调。 3.分化成熟中FGF23表达上调与其局部合成1,25(OH)2D的旁分泌／自分泌作用和细胞间通讯增强有关。