丹皮酚在骨性关节炎中的作用及其机制研究

骨性关节炎(Osteoarthritis,0A)是一种最常见的退行性关节病,是以关节软骨的破坏、软骨下骨的硬化、周围骨质增生和滑膜炎性增生性改变为特征的慢性炎症性关节疾病。其中,软骨的退变是骨关节炎的根本病变,但具体的机制仍较复杂,给早期的临床治疗带来了一定难度。自从上世纪80年代,随着材料科学的迅速崛起,人工关节被广泛应用于临床,对于症状严重的晚期OA患者,关节置换仍然是唯一能够阻断疾病进展的措施,但多年来OA的治疗策略一直没有大的变革。而且,由于术后假体的磨损和围手术期并发症的存在,关节置换也非尽善尽美。对于早、中期的OA患者,仍然还缺乏有效干预病程进展的治疗手段。因此深入的基础研究和临床探索对于早、中期OA治疗仍然很有必要。目前,早期的骨性关节炎可用药物治疗,临床上常用的药物主要包括选择性环氧合酶(Cyclooxygenase,COX)-2抑制剂、非甾体抗炎药(NSAIDs)、硫酸氨基葡萄糖、关节腔注射激素及透明质酸钠等,这些药物在一定程度上能缓解OA的症状,但并不能从根本上缓解OA的进展。而且非甾体抗炎药及COX-2抑制剂增加了胃肠道、心血管疾病的风险,特别是对老年人,也正是OA疾病的好发人群。过去的10年中,很多研究者在OA的发病原因、病理机制等方面做了大量的基础研究工作,并且取得了不少成果。既往认为OA属于老年性的退行性改变,一种非炎症性的软骨细胞退变。但目前,已有越来越多的证据表明炎症在OA的发病进程中起了重要的作用,多种炎症细胞因子与信号通路相互作用调控,使细胞合成代谢与分解代谢失衡,导致了 OA的发生、发展,OA已经被公认为是一种炎性疾病。关节软骨主要成分为透明软骨,主要由软骨细胞、纤维和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)组成,其中基质占了体积的95%。软骨细胞是成人透明软骨中唯一的细胞成分,对软骨基质的合成和分解起稳定作用。体内的一些促炎及抗炎因子正是通过对软骨细胞的作用打破了这种平衡,导致细胞外基质的稳态失衡。因此,目前研究控制OA的药物主要就是针对软骨细胞,通过软骨细胞进一步研究细胞外基质的合成及分解。丹皮酚是从牡丹的干燥根皮中提取出来的一种成分,既往研究表明,丹皮酚具有镇痛、抗炎、抗氧化、降血压和抑制变态反应等作用。丹皮酚在OA中的作用目前报道甚少。在本次研究中,我们探讨了丹皮酚在OA环境下对软骨细胞及软骨的作用及可能的分子机制。本研究分成如下三部分:一、进行正常的兔软骨细胞培养,检测丹皮酚对软骨细胞活性的影响。用白介素-1β(interleukin-1(β,IL-1β)刺激软骨细胞,造成细胞的炎性环境,然后用不同浓度梯度的丹皮酚干预,探索丹皮酚对软骨细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP),组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs),诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS),COX-2,前列腺素 E2(Prostaglandin E2,PGE2),一氧化氮(nitric oxide,NO)等因子表达的影响。我们研究发现,丹皮酚不影响软骨细胞的活性,并且能够减轻IL-1β诱导的软骨细胞中的炎症和拮抗细胞基质的降解,降低炎症因子及基质分解酶的表达。二、在兔子中用建立OA动物模型,观察丹皮酚对OA环境下的关节软骨的作用。研究发现丹皮酚能缓解骨关节炎的进展,减轻关节软骨损伤。三、在第一部分实验的基础上,在兔的软骨细胞中,观察丹皮酚对IL-1β刺激后的抗炎症和抗基质降解作用的具体机制,并在第二部分的实验中再次验证该机制,结果发现NF-κB信号通路的激活在丹皮酚对经IL-1β刺激后的软骨细胞抗炎症抗基质降解作用中起了重要作用。我们的研究结果表明,丹皮酚具有抗骨性关节炎作用。第一部分丹皮酚对OA软骨细胞的抗炎抗降解作用目的:观察丹皮酚对体外培养的兔关节软骨细胞的毒性作用;观察丹皮酚对IL-1β刺激的软骨细胞炎症降解作用。方法:取5周龄雌性(新西兰兔)兔膝关节软骨细胞体外分离培养,光镜下观察原代软骨细胞形态并用PCR法检测软骨细胞相关的特异性基因确定是软骨细胞后开始传代,传至3代稳定。用不同浓度的丹皮酚(25-200 mg/L))处理软骨细胞24小时,用MTT法检测软骨细胞的活性;在软骨细胞中加入IL-1β,孵育24小时,用PCR法检测细胞中MMP-1,MMP-3,MMP-13的基因表达变化,确认细胞炎症模型成功;用不同浓度丹皮酚干预经IL-1β刺激后的软骨细胞,用定时定量PCR法检测细胞内MMP-1,MMP-3,MMP-13,TIMP,iNOS和COX-2的基因表达变化,用ELISA法检测细胞培养上清液中PGE2和NO的含量变化。结果:丹皮酚在浓度到达200 mg/L时不会对软骨细胞产生毒性作用。丹皮酚抑制IL-1β介导的体外培养关节软骨细胞MMP-1,MMP-3,MMP-13,TIMP,iNOS和COX-2的基因表达,同时也减少细胞上清液中PGE2和NO的含量,而且有浓度梯度的趋势。结论:丹皮酚在浓度达200 mg/L时对软骨细胞无毒性作用;丹皮酚对体外培养的关节软骨细胞具有抗炎症抗降解作用。第二部分丹皮酚对兔OA关节软骨降解作用的观察目的:观察丹皮酚拮抗OA动物模型中关节软骨的降解作用方法:16只重约2.0kg的新西兰兔,将其中12只随机分为2组,每组6只,分为实验组和对照组,两组均在双侧膝关节行前交叉韧带切断术(anteriorcruciate ligament transaction,ACLT),余下4只作为正常组,不切断前交叉韧带,但余下手术步骤相同。造模一个月后实验组关节腔注射0.3ml丹皮酚(100mg/L),对照组注射溶剂DMSO,每周一次,持续6周,正常组不行关节腔注射。末次注射后1周取股骨侧膝关节标本,用实时定量PCR法检测关节软骨中MMP-1,MMP-3,MMP-13,TIMP,iNOS和COX-2的基因表达,并使用番红-固绿染色观察软骨的病变。结果:丹皮酚显著抑制OA关节软骨中的MMP-1,MMP-3,MMP-13,TIMP,iNOS和COX-2的基因表达。形态学结果提示实验组的关节软骨病变程度轻于对照组,组织学观察结果提示实验组的关节软骨损伤亦轻于对照组。结论:丹皮酚在体内可拮抗OA关节软骨降解退变,延缓OA的进展,为骨关节炎的预防、治疗提供新的方法和途径。第三部分丹酚在兔软骨细胞和OA动物模型中抗炎抗降解作用的分子机制研究目的:观察丹皮酚对IL-lβ介导的软骨细胞和OA动物模型中抗炎抗降解作用的分子机制。方法:取5周龄雌性兔膝关节软骨细胞体外分离培养后传至3代稳定。用10ng/ml的IL-lβ预处理1小时后,加入不同浓度丹皮酚24小时,使用Western blot检测软骨细胞中转录抑制因子(Inhibitor of nuclear factor kaββa B,IκBα)和磷酸化核转录因子(β-nuclear factor kaββa B,β-NF-κB)的表达。然后用l00mg/L的丹皮酚和NF-κB通路抑制剂JSH-23预处理1小时后,加入10ng/ml的IL-lβ,继续孵育24小时,收集软骨细胞,用PCR法检测MMP-1、MMP-3、MMP-13的基因表达变化。在第二部分的实验中,取相应数量的兔子,设立实验组、对照组、正常组,双侧膝关节行前交叉韧带切断术造模,造模一个月后实验组关节腔注射0.3ml丹皮酚(100mg/L),对照组注射溶剂DMSO,每周一次,持续6周,正常组不行关节腔注射。末次注射后1周取股骨侧膝关节标本,获取的标本,保存在液氮中,取出后行实时定量PCR检测软骨中NF-κB的基因表达水平。结果:丹皮酚显著抑制了软骨细胞中IL-1β介导的IκBα的降解和NF-κB的磷酸化。加入NF-κB通路抑制剂后丹皮酚对OA软骨细胞中MMP-1、MMP-3、MMP-13基因表达的抑制作用被减弱。丹皮酚在关节腔注射可以显著抑制OA软骨中的NF-κB的基因表达。结论:丹皮酚可以通过抑制NF-κB信号通路拮抗IL-1β介导的软骨细胞炎症降解作用。体内实验进一步证实了丹皮酚可通过抑制NF-κB信号通路保护OA的软骨。