桂皮醛对CVB3诱发的小鼠病毒性心肌炎的作用机制研究

病毒性心肌炎(Viral Moycarditis,VMC)是临床多发病,目前尚缺乏有效治疗药物和措施,严重的威胁人们的健康。肠道病毒中的柯萨奇病毒B组3型(Coxsackie B virus 3,CVB3)是诱发VMC的主要病原体,可直接导致心肌细胞病变和死亡,并激活内源性阿片系统,引起循环中β-内啡肽(β-endogenous opioid peptide,β-EP)水平升高及心肌细胞膜上β-EP受体结合容量改变[1],通过神经内分泌-免疫网络,激活核转录因子(nuclear factor kappa B,NF-κB);CVB3还可通过Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4),激活TLR4-NF-κB信号转导途径,激活NF-κB,引起一系列的炎症应答,造成心肌细胞进一步损伤,使VMC进一步发展或出现充血性心力衰竭。因此,研究药物抑制CVB3在体内的复制、降低β-EP水平、抑制TLR4-NF-κB信号转导途径引起的炎症反应对VMC的治疗作用,不仅对阐明VMC的病理转归具有重要意义,而且为发现和开发抗VMC的有效治疗药物提供新的治疗思路。 桂皮醛(Cinnamaldehyde,CA)是樟科植物肉桂(Cinamonum cassia Presl)的干皮及树皮经水蒸馏得到的挥发油——肉桂油(Cinnamaon oil,OC)的主要成分,药典规定其含量大于75%[3]。已有的药理学研究表明,CA具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等作用[4-6],对中枢神经系统(central nervous system ,CNC)以及免疫系统有一定的影响[7-8]。K. Hayashi.等[9](2007)研究证实在体内、外对流感A/PR/8病毒具有抑制作用;到2008年Youn HS等[10]进一步证实CA对体外LPS诱发TLR4-NF-κB信号转导途径具有显著抑制作用。 我们前期的研究证实[11]OC和CA对CVB3诱发性小鼠VMC具有明显治疗作用,其治疗效果优于黄芪注射液和病毒唑;并证明OC中抗VMC的药理活性成分是CA。但是,CA对CVB3诱发性VMC的作用机制尚不清楚;由于CA的化学性质不稳定,其在体内可迅速被氧化为肉桂酸(Cinnamic acid,CD),其血浆半衰期为9min ,那么CA是通过其本身还是体内代谢产物即CD对VMC发挥治疗作用的也不明确。对此,本课题就以CD为对照组,从体内外两方面展开研究。 研究目的 首先探讨CA、CD体内、外抗CVB3的作用与作用机制;其次观察CA、CD对CVB3诱发性VMC小鼠心肌细кOR水平以及TLR4-NF-κB信号转导途径等指标的影响,评价CA治疗VMC的作用机制。 研究内容 第一部分:体外实验 1 CA和CD的细胞毒性实验 1.1方法培养原代心肌细胞,心肌细胞以1×105/孔接种于24孔板培养。待细胞生长成片后,加入0-1000μM含有CA、CD的培养液孵育72h。同时设置空白对照组,比较各组细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、MTT法检测细胞存活率(n=3)。 1.2结果CA对心肌细胞的LogIC50为-4.125。0.1-1000μM CA呈剂量依赖性抑制心肌细胞的活性,0.1,1,10,100μM CA对心肌细胞存活率分别为70%,54%,13%和0%。而1000μM CD对心肌细胞未见CPE,该剂量组的心肌细胞存活率为97%。0.1-1000μM CD的心肌细胞存活率明显高于CA各组(P<0.01)。 1.3结论CA对心肌细胞的LogIC50为-4.125。大于0.1μM的CA对心肌细胞具有毒性;CD在0.01-1000μM的浓度范围未见细胞毒性。提示CA对心肌细胞具有显著毒性,分析其毒性可能与其醛基相关。 2 CA和CD体外抗CVB3的作用研究 2.1方法心肌细胞以1×105/孔接种于24孔板培养。待细胞生长成片后,接种CVB3,孵育后1 h给予0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000μM CA和CD,72h后观察CPE,在HeLa细胞上测定病毒滴度,设立CVB3病毒和空白对照组(n = 3),确定量效关系。 2.2结果10-1000μM CD各组呈剂量依赖性抑制心肌细胞中的病毒滴度(P<0.01),细胞存活率高于CA各组和CVB组(P<0.01)。100-1000μM CA组病毒滴度低于CVB组(P<0.01),而细胞存活率与CVB组无统计学差异(P>0.01)。 2.3结论10-1000μM CD可降低感染CVB3心肌细胞的病毒滴度,对心肌细胞具有保护作用;100-1000μM CA在体外具有抗CVB3病毒的作用,但同时对宿主细胞也产生明显毒性。 3 CA和CD体外抗CVB3的作用机制研究 3.1方法心肌细胞以1×105/孔接种于24孔板培养。细胞生长成片后,分别于接种CVB3前1h(-1h)、接种同时(0h)和接种后1h(1h)给予100μMCA、100μM CD各100μL,同时设CVB3及空白对照组;孵育72h,观察CPE,MTT测定细胞存活率,并进行病毒中和抗体、免疫荧光实验和电镜观察,探讨各试药的抗病毒作用机制。 3.2结果接种CVB3-1h、0h和1h分别给予100μM CD100μL,其病毒滴度显著低于CVB组(P<0.01),细胞存活率高于CA组和CVB组(P<0.01),三组不同接种时间CVB3的CD组之间,组间比较无显著差异(P>0.05),提示CD对CVB3感染无预防性保护作用,电镜和免疫荧光实验显示CD对CVB3有直接灭活和抑制病毒在细胞内的复制作用。接种CVB301h给予CA,其病毒滴度低于CVB组(P<0.01),但细胞存活率与CVB组无显著性差异(P>0.01)。 3.3结论CA在体外可直接灭活CVB3,但对心肌细胞具有明显毒性;CD可直接杀灭CVB3和抑制CVB3在细胞内的复制,但对CVB3感染无预防作用。 第二部分:体内实验部分 1 VMC小鼠心肌组织中кORmRNA和蛋白表达的变化 1.1方法50只BALB/c小鼠以10-5.09IU/mLCVB3 i.p100μL诱导小鼠VMC模型,在隔离实验室饲养。另取15只BALB/c小鼠同法接种100μL不含病毒的Eagle液。分别在病毒感染后第5、7、14、21、28天,随机取3只小鼠,处死,留取心肌组织。采用RT-PCR和WESTERN BLOT技术检测CVB3感染后各时间点小鼠心肌组织中κORmRNA和蛋白质的表达水平。 1.2结果CVB3感染后第5、7、14、21天,κORmRNA表达量显著高于正常组(P<0.01);而κOR蛋白质的表达量在CVB3感染后第7、14、21天明显高于正常组(P<0.05)。 1.3结论首次发现CVB3诱导性VMC小鼠心肌细胞的κOR基因和蛋白质水平明显上调,提示κOR参与了VMC的病理过程。 2探讨CA治疗VMC小鼠的作用机制 2.1方法150只BALB/c小鼠分为5组(n=30),100μL 10-5.09IU/mL CVB3 i.p诱导小鼠VMC模型,在隔离实验室饲养。另取16只BALB/c小鼠作为对照组,接种100μL不含病毒的Eagle液。于接种病毒后72h各组分别给药,对照组i.p 2500mg/kg NS;CVB3组i.p 2500mg/kg NS;纳络酮(NXL)组i.p 2mg/kg; U50,488H组i.p 30mg/kg;CA组i.p 30mg/kg;CD组i.p 30mg/kg,连续给药至21天。病毒感染后第10天(n=8)和21天、各组随机取小鼠称体重,摘眼球取血后处死,取心脏,计算心脏重量/体重比;心脏一分为二,一半用作κORmRNA、CVB3mRNA、TLR4mRNA的RT-PCR检测和WESTERN BLOT技术检测κOR和TLR4蛋白质的表达水平;另一半作石蜡切片,HE染色和制片作NF-κB免疫组化染色;以ELASA试剂盒检测血浆中β-EP水平;整个实验期间观察纪录小鼠累积死亡数及存活时间。 2.2结果与CVB3组比较,CA组与U50,488H组可显著延长VMC小鼠中位生存时间,降低心脏指数;对CVB3感染后第10、21天的病理评分,κORmRNA、TLR4mRNA和蛋白质的表达水平均呈现抑制作用(P<0.05-0.01);对感染21天血浆中β-EP水平亦呈抑制作用。NXL组可延长VMC小鼠中位生存时间,降低感染后第10、21天血浆中β-EP水平和第21天小鼠心肌病理病变(P<0.05)。CD组对感染后第21天小鼠心肌病理病变较CVB3组明显降低(P<0.05)。CA组和CD组可显著降低病毒感染后第10、21天CVB3mRNA表达(P<0.01),且感染第14天CA组的病理评分轻于CD组;这提示CA的抗CVB3作用是通过其在体内的代谢产物即CD产生的。 2.3结论CA治疗CVB3诱发性小鼠VMC可能的作用机制:一是部分CA通过其体内代谢产物CD发挥抗CVB3作用;二是CA可抑制TLR4-NF-κB信号转导途径从而抑制VMC小鼠心肌的炎症反应;三是CA对体内κOR具有与U50,488H相同的活性作用,但其是否能通过κOR抑制VMC时心律失常尚需进一步研究求证。