肾康丸对糖尿病肾病足细胞及podocin蛋白的影响

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）常见的慢性微血管并发症之一，一旦发病病情则不可逆的慢性进展，最后发展为慢性肾衰竭终末期肾病（ESRD），是DM患者的主要死亡原因之一。随着我国经济和社会的发展、生活和工作方式的改变，DM的发病率明显升高。据统计，2000年DM患者总量已达3100万人，患病率达到2.4％，而且患病率还在逐年增加。由于医疗条件的改善和国民医疗卫生意识的加强，DM患者的生存期大大延长，从而导致DM的慢性微血管并发症的发生率增高，DN的发病率也随之明显增高。因DN的发生加重了患者代谢紊乱，造成心脑血管等大血管并发症的发病率、致死率进一步增加。但因DN发病机制复杂，机制作用靶点众多，而且许多机制尚不明确，到目前为止，尚没有一种的治疗方法或药物可以完全有效的治疗DN，寻找一种安全、高效、低毒、低价的治疗药物或方法已经刻不容缓。 明确的疾病发病机制是寻找有效治疗方法的基础，因此近年对DN的发病机制进行了大量深入的研究，并已经证实，肾小球足细胞及其相关分子的改变在DN的发生和发展中起到关键性作用。研究发现1型、2型DN患者均出现足细胞相关蛋白表达下调，分布改变；足细胞凋亡、脱落、足细胞数目减少；足细胞形态的改变：足细胞肥大、足突融合、消失等病理变化，上述改变随DN的病情进展逐渐加重，通过纠正上述病理变化可以明显改善DN临床症状、延缓DN的进展。足细胞相临足突之间的裂孔隔膜（SD）是构成肾小球滤过屏障的重要组成部分，研究发现SD是由SD相关蛋白构成的蛋白复合体，对维持足细胞的形态具有重要的作用，同时还可以介导细胞外信号转导，从而激活一系列下游生物反应。Podocin是组成SD的重要功能蛋白之一，其缺失或功能异常可导致严重的蛋白尿、肾功能损伤及肾小球足突的广泛融合，提示podocin对维持肾脏的功能具有重要的作用。但目前有关podocin在DN中的改变以及作用机制的研究较少，而且部分研究的结果不统一，完全有必要对其进行深入的研究。 由于DN缺乏有效的西医治疗药物，而中医治疗学的精髓“治病求本”，以及中药的多靶点治疗作用必然使其成为一种行之有效的治疗方法。但是祖国医学中并无DN的论述，目前大多数学者将其归属于“消渴”并发“水肿”“水病”“尿浊”“腰痛”“肾劳”“关格”等范畴，认为其病机为本虚标实，本虚是指脾肾气血、阴阳亏虚，标实是指瘀血、痰饮、水湿、浊毒等。病情常按照气虚或阴虚—气阴两虚—阴阳两虚规律动态发展，并兼夹瘀血、水湿、痰浊等标证，尤其在病情早期和中期常见脾肾亏虚、气阴两伤、瘀血阻络的证候。肾康丸一方由黄芪、芡实、水蛭等组成。功效：益气健脾，滋阴补肾，活血通络。主治DN见脾肾亏虚、气阴两伤、瘀血阻络的证候者。已作为珠江医院的医院制剂，临床应用多年，疗效确切。该药可在一定程度上改善DN一般症状，保护肾脏，延缓DN的进展。但其治疗DN的分子水平的作用机制还不清楚，有待进一步研究。 因此，本研究假定在DN时出现podocin的表达的异常，造成SD功能和结构、足细胞形态的改变，导致肾脏功能的损伤，在使用肾康丸治疗后可以通过纠正podocin表达的异常改变，改善或减轻SD和足细胞的损伤，保护肾脏功能，延缓甚至阻断DN的进行性发展。实验通过建立DN动物模型，并使用肾康丸进行干预后，观察和检测相应指标以及podocin蛋白和mRNA的表达，探讨肾康丸治疗DN的分子作用机制，为其临床应用和推广提供实验依据，并进一步明确DN的发生发展机制，寻找新的治疗靶点。具体如下： 实验一肾康丸对DN大鼠足细胞和肾脏的保护作用实验研究 目的：观察肾康丸对DN大鼠模型足细胞和肾脏的保护作用，为药物的临床应用和进一步研究其作用机制提供实验依据。 方法：首先以链脲佐菌素（STZ）按60mg·kg-1大鼠体重于禁食8h后一次性腹腔内注射法建立大鼠DM模型，4周后测定血糖，尿量和尿蛋白排泄率，以大鼠血糖＞16.6mmol·L-1，尿量＞原尿量150％，尿蛋白排泄＞30mg·kg-1·24h-1者为DN成模，计算成模率。成模后模型大鼠随机分为4组：模型对照组、肾康丸组、安博维组、中西医结合组，另设正常对照组。灌胃给药每天1次治疗8周，治疗期间观察和测定大鼠一般状况、体重、血糖、尿糖、24 h尿量、饮水量和24h尿蛋白总量（Upro）等。末次给药后将大鼠入代谢笼中，收集24 h尿样测定尿糖、24 h Upro，记录饮水量。测定尾尖血糖、称量体重，然后用10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主动脉穿刺采血，分离血清，检测大鼠血清白蛋白（Alb）、甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿肌酐（Ucr）等，并计算内生肌酐清除率（Ccr）；观察肾脏大小和性状，取大鼠肾脏，称量肾重、计算相对肾重；HE染色和光镜、透视电镜观察足细胞形态及肾脏组织病理变化。 统计学方法：计量资料以均数±标准差(（?）±s)表示。应用SPSS13.0统计软件包进行数据的统计分析。治疗前或治疗后组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），部分重复测量数据采用重复测量方差分析（Reperted measurement experiment），方差不齐者进行数据变换后再比较，组间多重比较采用LSD法。等级资料采取多个独立样本的非参数检验（K Independent Samples Test）Kruskal-Wallis H或多个相关样本的非参数检验（K Related Samples Test）。各检验方法的显著性标准均为P＜0.05。 结果：32只大鼠用于造模，DM成模29只，成模率90.60％（29／32）。4周后DN成模，成模前死亡3只，分组干预后死亡3只，病死率20.69％（6／29）。在分组干预的的8周里，模型组大鼠血糖均维持在16.6 mmol·L-1以上，尿糖+++～++++；全部表现出多饮、多食、多尿、消瘦的DM症状；与正常对照大鼠比较，模型对照大鼠Ccr、24h Upro、TG、TC等指标均升高，肾脏重量及相对肾重增加，体重、Alb和Scr降低，差别都具有统计学意义（P值均＜0.001）；并出现了足细胞肥大、排列紊乱、足突增宽融合、足突间隙减少、系膜基质增加、系膜区增宽、基底膜增厚等DN病理损害。经过治疗后，肾康丸、安博维和中西医结合治疗均可显著改善模型大鼠大鼠一般状况，肾康丸和中西医结合可以显著增加体重、减少尿量和饮水量（P值均＜0.05），安博维组则无显著改变（P值均＞0.05）；3组都可以显著降低24h Upro和血糖（P＜0.01或P＜0.05），肾康丸和中西医结合并可以显著降低TG、TC和提高Alb（P＜0.01或P＜0.05），安博维组的变化则无统计学意义（P值均＞0.05），但3组治疗对尿糖均无显著影响（P值均＞0.05）；3组都可显著改善肾脏高滤过状态：Scr、Ccr出现相应的改变，差异显著（P＜0.01或P＜0.05）；显著降低肾脏重量及相对肾重（P值均＜0.01），减轻足细胞肥大增生，改善足细胞排列紊乱、足突融合等肾脏组织病理损害。上述指标在3个治疗组之间均未见显著性差异。 结论：肾康丸具有治疗DN大鼠，保护大鼠肾脏的作用，并在某些方面可能优于安博维，完全可能成为一种治疗DN的新药。 实验二肾康丸对DN大鼠肾小球足细胞相关蛋白podocin的影响 目的：研究DN大鼠足细胞相关蛋白podocin的改变及肾康丸对其的影响，探讨DN发病机制和肾康丸治疗DN的可能分子机制。 方法：标本来源于取第1章各组大鼠肾组织，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法观察各组大鼠肾脏组织podocin mRNA基因表达情况；采用免疫组化法和蛋白质免疫印迹法（Western blotting）定位、半定量以及定量分析各组大鼠肾脏组织podocin蛋白的表达情况。 统计学方法：计量资料结果用均数±标准差(（?）±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件包进行数据的统计分析。Podocin mRNA及蛋白的相对表达量采用One-Way ANOVA进行统计分析，组间两两显著性比较采用LSD法，podocin的相对表达量和24h尿蛋白的相关性分析采用双变量相关分析（Bivariate） Pearson相关分析方法，显著性标准为P＜0.05。 结果：DN模型对照组大鼠与正常对照大鼠比较，肾脏组织中podocin mRNA的表达显著下调（P＜0.001）。半定量、定量分析发现模型对照组大鼠肾脏组织中podocin蛋白的表达与正常对照组大鼠比较也显著下调（P＜0.001），而且podocin蛋白的表达与24h尿蛋白量呈较为显著的负相关（r=—0.621，P＜0.001）。与模型对照组比较，肾康丸、安博维和中西医结合治疗都可以显著提高DN大鼠肾脏组织中podocin mRNA的表达，差异具有统计学意义（P≤0.004），并且都可以显著增加DN大鼠肾脏组织中蛋白的表达，差异显著（P≤0.024）。虽与正常对照组比较肾康丸组podocin蛋白的表达无显著性差异，但其mRNA的表达却有所下调（P=0.007），而安博维和中西医结合治疗组则无显著性差异（P≥0.097）。3组podocin蛋白的表达与正常对照组比较均未见显著改变（P≥0.057）。定位分析分析各组均未见明显podocin分布的异常。 结论：Podocin蛋白和mRNA的表达的下调可能在DN的发生和进展中起到重要的作用，肾康丸可以通过上调podocin的表达起到治疗和延缓DN进程的作用，此可能成为一个新的治疗靶点。 全文结论：本研究通过对STZ诱导的DN动物模型的实验研究，再次证明肾康丸具有治疗DN和保护肾脏的作用；并证实podocin蛋白和mRNA的表达在DN发生时出现下调，而且此改变可能是DN发生和进展的分子机制之一，在DN发生和进展中起到重要的作用，肾康丸可以通过上调DN中podocin蛋白mRNA的表达阻止DN的发生和发展，因此是肾康丸治疗DN的分子机制之一。本实验进一步明确了DN的发病机制，并认为podocin的变化可能成为一个新的DN治疗靶点；也进一步明确了肾康丸治疗DN的分子机制，为肾康丸的开发、推广和临床应用提供了实验依据。