二咖啡酰奎宁酸抗实验性肝损伤及肝纤维化的研究

1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸（Dicaffeoylguinic Acid，IBE5）是咖啡酰 奎宁酸类化合物，为中药旋覆花的有效成分，以往研究表明，其结构 类似物菜蓟素（Cyrarin 1，3-二-O-咖啡酰奎宁酸）具有保肝利胆作用，对 巨噬细胞及四氯化碳引起的肝损伤具有保护作用，IBE5是否具有抗肝 损伤作用及其作用机制尚不清楚。本文在细胞及整体水平研究IBE5的 抗肝损伤作用，并初步探讨其作用的可能机理，为其今后应用于临床 提供实验证据。实验分为以下几个部分： 一、1，5-二-O-二咖啡酰奎宁酸（IBE5）的分离纯化 对中药旋覆花进行提取分离，过程为：旋覆花乙醇提取物→乙酸 乙酯萃取部分→硅胶柱层析分离组分IBE→硅胶和Sephadex LH20柱 层析分离纯化→得到化合物5（IBE5）。 二、体外实验： （一）二咖啡酰奎宁酸对大鼠肝原代细胞的保护作用 以大鼠肝原代细胞为靶细胞。采用四率化碳（CCl4）、二甲基亚硝 胺（DMN）损伤方法制造肝细胞损伤模型。分别采用[3H]-胸腺嘧啶 （［3H］-TdR），［3H］-脯氨酸（［3H］-Pro）掺入，流式细胞术等方法，观察 IBE5对其增殖、活力、细胞增殖周期及凋亡等的影响，结果发现，IBE5 在7.8μg.ml-1～250μg.ml-1浓度对细胞均无明显毒性作用，却能促进 肝细胞增殖及活力，对CCl4、DMN引起的肝细胞调亡可起到抑制作用。 （二）二咖啡酰奎宁酸对NIH/3T3细胞的影响 以体外培养的NIH/3T3细胞作为肝脏成纤维细胞的替代模型， 探讨IBE5抗肝纤维化的作用机制。将7.8μg.ml-1～250μg.ml-1浓度的 IBE5加入细胞中培养24h，采用［3H］-TdR掺入法测定细胞增殖率，［3H］- Pro掺入法测定细胞活力，［勺］Pro掺入、胶原酶消化法测定细胞内外 胶原合成率，放射兔疫分析法测细胞上清透明质酸（HA）含量。结果 显示，以上浓度的IBES对细胞均无毒性，各浓度均可显著抑制细胞增 殖，促进细胞活力，明显抑制胶原和透明质酸的合成，以25Opg．m卜 为最佳浓度，从而为IBES抗肝损伤提供体外实验依据。 三、体内部分： （一）旧ES抗复合因素致大鼠肝损伤 实验在复合因素（皮下注射 40％植物油溶液 0．3ml／100 u g．b．W， 2次／周，附以 10％乙醇为唯一饮料。玉米面中添加 0．2％胆固醇和 20％ 猪油为饲料）所致大鼠肝纤维化模型上观察IBES对肝纤维化及肝硬化 的影响。结果表明：IBES 50 mg上g“‘～200mg．kg‘可减轻肝纤维化及肝 硬化程度，降低肝脏血清AST、ALT、透明质酸（HA）合成及层粘连 蛋白（LN）水平，降低血清丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量， 明显减轻肝脏脂质过氧化程度，组织学检查同样显示出其抗肝纤维化 的作用。 （二）IBES抗二甲基亚硝胺（DMN）致大鼠肝损伤 采用DMN作为肝损伤的诱导剂，分别致大鼠急慢性肝损伤，研 究 IBES对化学性肝损伤的防治作用。结果显不：6 mg上g“‘～50 mg上g“’ IBES对DMN所致急慢性肝损伤均具有较好的防治作用，可改善肝功 能，降低肝脏HA、LN、CIV、PClll等血清纤维化水平，降低肝脏血 清脂质过氧化水平，改善肝组织病理损害，明显优于模型对照组 (＜0刀5～0刀01卜因此，可以认为1＊＊5具有良好的抗化学性肝损伤作 ！用。 （三）旧ES抗缺血再灌注致肝损伤 采用大鼠肝脏缺血再灌注作为肝损伤模型，应用肝功能KST， ALT，TP，ALB)，血清肝纤维化指标mA，LN)，脂质过氧化水平（MDA， NO）及形态学方法作为检测指标，观察IBES的抗肝损伤作用。实验结 果显示：6 mg．kg’～50 mg上g”IBES可以降低肝纤维化水平，改善肝功 能，降低肝脏血清脂质过氧化水平，促进肝组织病理损害好转，显著 －3－ 优于模型对照组。 综上所述，IBES是从中药旋覆花中提取的咖啡酚奎宁酸类化合 物。IBES抗实验性肝损伤作用属首次发现，为具有抗物理性、化学性、 复合因素肝损伤作用的新型化合物。共同作用表现在：可明显降低血 清AST、ALT水平，提高蛋白合成率；显著降低血清肝纤维化四项指 标；对病理损伤有明显的改善，降低组织纤维化程度，改善超微结构。 其作用机理为促进肝原代细胞增殖，改变受损细胞的增殖周期，抑制 正常肝细胞凋亡。而对成纤维细胞则具有显著的增殖抑制作用，并能 降低成纤维细胞透明质酸水平。研究提示，IBES可望成为一个抗肝损 伤及肝纤维化新型化合物。