鸡脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其与肌内脂肪含量关系的研究

本研究通过构建北京油鸡基因组DNA噬菌体文库，筛选含鸡心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因的重组子，克隆出4株含鸡H-FABP基因片段的重组噬菌体。选用北京油鸡、矮脚鸡、泰和乌骨鸡、崇仁麻鸡、鹿苑鸡、霞烟鸡6个中国地方鸡品种以及一个引进品种爱拔益加肉鸡（AA鸡）共7个实验动物群体，将H-FABP基因和脂肪型脂肪酸结合蛋白（A-FABP）基因作为影响肌内脂肪含量的侯选基因，采用PCR-RFLP及PCR-SSCP分析方法研究H、A-FABP基因上的遗传变异，运用最小二乘法拟合线性模型，对所发现的多态位点与鸡生产性状的关系进行了分析，探讨了H、A-FABP基因作为影响鸡肉品质侯选基因的可能性。所得结果如下： 1、在λ噬菌体EMBL3中构建了北京油鸡基因组DNA文库，滴度为3.84×10～5，基本上保证了文库的代表性。 2、根据Genbank上一段从鸡脂肪文库中克隆的、与大鼠H-FABP基因有较高同源性的序列，通过比较不同物种间H-FABP基因核苷酸序列的相似性与同源性，在保守区设计特异性扩增引物P1，首次扩增出鸡H-FABP基因第二内含子2Kb片段，并根据序列测定结果设计引物P2，扩增其中221bp的片段，用于对基因组文库进行PCR法初选，确定含鸡H-FABP基因片段的阳性克隆所在的文库亚集。再以H-FABP基因第二内含子2Kb片段为模板，采用地高辛标记随机引物法合成标记探针，经Southern杂交对文库亚集进一步筛选，确定了4个含目的基因片段的阳性克隆，为进一步亚克隆测定鸡H-FABP基因的全序列提供了基础。 3、应用PCR-RFLP分析在鸡H-FABP基因第二内含子上发现HhaⅠ-RFLP和MspⅠ-RFLP两个多态位点，其中HhaⅠ-RFLP位点上有三个等位基因A、B、C。测序分析表明：多态的产生是由于386位以及723位碱基T→C的替换造成的；MspⅠ-RFLP位点上有两个等位基因M、N，多态位点的产生是由于246位碱基T→C的替换造成的。根据鸡A-FABP基因第四外显子及第二内含子序列设计特异性引物P3，用于扩增含鸡A-FABP基因第三内含子的1.5Kb片段，在第三内含子上发现一HinfⅠ-RFLP多态位点，该位点上有两个等位基因A、B。测序分析表明：HinfⅠ-RFLP的产生是由于700位碱基G→A的替换造成的。在北京油鸡和矮脚鸡两个群体共计505只个体中分析了三个PCR-RFLP位点的基因型分布情况，Hardy-Weinberg平衡适合性检验结果表明：北京油鸡群体在H-FABP基因HhaⅠ及A-FABP基因HinfⅠ-RFLP位点上处于平衡状态；矮脚鸡群体在A-FABP基因HinfⅠ-RFLP位点上处于平衡状态，在HhaⅠ位点上处于不平衡状态；在MspⅠ-RFLP位点上两群体均处于不平衡状态。另经x2独立性检验表明在北京油鸡与矮脚鸡群体中HhaⅠ、MspⅠ、HinfⅠ-RFLP各位点的基因型分布存在极 显著的差异（Prto．of）。 4、根据鸡A－FABP基因第一外显子及第一内含子序列设计特异性扩增引物 p4－P．，应用PCR－SSCP分析在A－FABP基因上发现P。、P。、Ps－SSCP H个多态位点， 每个位点上都具有两个等位基因A、B。序列测定的结果表明：P。、p6《SCP单核 着酸的变异是由碱基C—T的替换造成的，Ps－SSCP多态的产生是由G—A的替换 造成的。对七个鸡群体共计728只个体三个PCR－SSCP位点的基因型分布情况进 行了统计分析，Hardy叩einberg平衡适合性检验结果表明：除P厂SSCP在霞烟鸡 群体中未处于Hardy－Weinberg平衡状态外，7个地方鸡品种民、Ps及P。－SSCP的 基因频率和基因型频率都处于平衡状态(Ptoo．05厂另经 X’独立性检验表明在不 同的鸡品种间 P。、Ps、PJSSCP的基因型分布存在极显著的差异（P＜0．01）。 5、应用SAS软件、用最小二乘法拟合一般线性模型（GLM）在北京油鸡及 矮脚鸡群体中对所发现的6个多态位点各标记基因型间生产性状（特别是肌内脂 肪含量）的差异进行显著性检验。统计结果表明不同的基因型之间生产性状有显 著的差异。目前的分析初步确定鸡H、A－FABP基因可以作为影响鸡肌肉脂肪含 量的侯选基因，有待于进行深入的研究。