氧化苦参碱对小鼠急性免疫性肝损伤的早期干预效果及Th1/Th2类细胞因子的影响研究

肝脏疾病是人类最常见的疾病之一,严重威胁着人类健康。目前对氧化苦参碱保肝作用的研究多致力于慢性肝损伤后的抗肝纤维化研究,而对其早期抗肝损伤的干预作用报道不多。本研究的目的:观察氧化苦参碱对刀豆素蛋白A(ConA)诱导的小鼠急性免疫性肝损伤的早期干预效果及干预过程中相关细胞因子的变化,希翼能为氧化苦参碱早期介入急性免疫性肝损伤的治疗提供实验室依据。 方法:将Balb/c小鼠随机分为四组:正常对照组,肝损伤组,氧化苦参碱对照组,氧化苦参碱治疗组。正常对照组及氧化苦参碱对照组(OM对照组)尾静脉注射生理盐水0.3ml,而肝损伤组及氧化苦参碱治疗组(OM治疗组)尾静脉注射0.3ml (12.5mg/Kg)ConA一次。此外OM对照组经腹腔注射氧化苦参碱(60mg/Kg),每24h注射一次。OM治疗组在尾静脉注射ConA前半小时预先经腹腔注射氧化苦参碱注射液60mg/Kg,之后每24h注射一次。各组分别于ConA注射后8h,24h,72h取材,进行下列研究:①用HE染色、IL-1和TGF-β1免疫组化等方法对各组小鼠肝组织进行病理学观察。②经眼球取血,收集血清测ALT和AST。③收集各组小鼠血清及新鲜肝、脾组织(各100mg),获取肝、脾组织裂解液。用多参数细胞因子检测技术即FlowCytomix技术,通过流氏细胞仪对荧光素PE信号强度的检测,实现对各组小鼠血清、肝组织、脾组织内多种Th1/Th2类因子的定性定量分析。所得数据经FlowCytomix Pro 2.2 Software分析软件进行分析后得出结论,并对结果进行分析讨论。 结果:①组织学结果:HE染色:正常对照组和OM对照组肝组织结构正常。肝损伤组8h时表现为急性肝损伤表现,肝细胞水肿,血窦充血明显,可见散在坏死灶,有淋巴细胞浸润。24h时可见大片坏死灶,周围有大量淋巴细胞浸润,血窦充血减轻。72h时肝损伤缓解,肝细胞水肿和窦充血明显减轻,坏死灶开始被吸收。OM治疗组8h时肝细胞水肿、坏死,可见散在坏死灶,血窦充血明显。24h时肝损伤明显缓解,肝细胞结构较肝损伤组好,可见局限坏死灶,周围有淋巴细胞浸润,血窦充血减轻。72h时肝细胞轮廓清楚,轻度水肿,坏死灶被吸收,残留部位周围有淋巴细胞浸润,血窦充血明显减轻。免疫组化结果: IL-1表达情况:正常对照组和OM对照组小鼠肝组织内未发现IL-1阳性表达。肝损伤组和OM治疗组3个时间点小鼠肝组织内均有IL-1阳性表达,主要表达于肝枯否氏细胞和肝细胞胞质内,呈棕黄色颗粒,与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.05)。OM治疗组与肝损伤组比较,8h和72h(3.87±0.57 VS 2.67±1.07;1.43±0.97VS 2.57±0.52)有显著性差异,P<0.05。其中8h时OM治疗组IL-1表达强于肝损伤组,72h时IL-1表达表达低于肝损伤组。24h时两组(2.81±0.86 VS 3.00±0.63)无显著性差异,P>0.05。TGF-β1表达情况:正常对照组OM对照组未发现TGF-β1阳性细胞表达。肝损伤组和OM治疗组可见TGF-β1阳性细胞有明显表达,呈棕黄色颗粒,与正常对照组比较3个时间段均有显著性差异,P<0.05。OM治疗组和肝损伤组比较,3个时间段均有显著性差异,其中OM治疗组阳性表达在8h时强于肝损伤组(5.07±0.93 VS 3.87±0.89),24h和72h时低于肝损伤组(3.17±0.56 VS 4.13±0.82,P<0.05;2.74±0.74 VS 3.77±0.52,P<0.05),差异有显著性。 ②血清ALT和AST检测:OM对照组3个时间点内无明显升高,差异无显著性,P>0.05。肝损伤组和OM治疗组3个时间段内ALT和AST均高于正常对照组,有显著性差异,P<0.05。OM治疗组与肝损伤组比较,8h时ALT和AST(360.14±65.64 VS 237.17±91.7;508.28±92.79 VS 367.33±103.13)均明显高于肝损伤组,有显著性差异,P<0.05。24h时ALT(84.57±5.97 VS 150.33±13.98)明显低于肝损伤组,有显著性差异,P<0.05,而AST(245.42±61.63 VS 281.00±42.96)无显著性差异,P>0.05。72h时ALT和AST(60.57±13.23 VS 64.50±9.54;152.28±19.68 VS 143.67±5.57)无显著性差异,P>0.05。 ③Th1/Th2细胞因子检测结果:肝脏:肝损伤组8h时Th1(IL-1,IL-2,IFN-γ,TNF-α)和Th2(IL-4,IL-6,IL-10)均明显升高,与正常对照组比较有显著性差异,P<0.05,24h后开始下降,降至正常水平或正常水平以下,呈明显下降趋势。OM对照组Th1(IL-1和IFN-γ)升高,与正常对照组比较有统计学意义,P<0.05,其中IFN-γ在72h时降至正常水平,呈下降趋势,而其他细胞因子无显著变化。Th2(IL-4,IL-6,IL-10),与正常对照组比较均显著升高,P<0.05,3个时间点趋于相同水平。OM治疗组Th1类细胞因子中只有IL-1在8h和24h明显升高,与正常对照组比较均有显著性差异,P<0.05,24h后呈下降趋势。其他细胞因子位于正常水平或低于正常水平。Th2(IL-6和IL-10)8h时显著升高,P<0.05,24h及72h时IL-6呈下降趋势,而IL-10呈上升趋势。与肝损伤组比较,OM治疗组Th1类因子中只有IL-1 8h和24h高于肝损伤组,Th2类细胞因子中IL-10 24h和72h时高于肝损伤组,有显著性差异,P<0.05。血清:肝损伤组Th1(IL-2,IFN-γ),Th2(IL-6)类细胞因子8h均升高,与正常对照组比较,有显著性差异,P<0.05,24h后逐步降低。OM对照组Th1(IL-2,IFN-γ),Th2(IL-4,IL-6,IL-10)类细胞因子与正常对照组比较无显著升高。OM治疗组Th1(IL-2,IFN-γ),Th2(IL-6,IL-10)类细胞因子8h均升高明显,与正常对照组比较有显著性差异,P<0.05,24h时明显降低。OM治疗组与肝损伤组比较,OM治疗组8h时IL-1,IL-2,IFN-γ均高于肝损伤组,24h和72h时IL-10高于肝损伤组。脾脏:肝损伤组Th1(IL-2,IFN-γ),Th2(IL-6)类细胞因子8h时均升高,与正常对照组比较,有显著性差异,P<0.05。24h时明显降低。OM对照组Th1(IL-2,IFN-γ),Th2(IL-4,IL-6)类细胞因子与正常对照组比较无明显升高。OM治疗组Th1(IL-2,IFN-γ),Th2(IL-4,IL-6)类细胞因子8h升高,与正常对照组比较,有显著性差异,P<0.05,72h时明显降低。 结论: 1 ConA诱导的急性免疫性肝损伤主要是由Th1类细胞、巨噬细胞和Th2类细胞分泌的炎性因子所造成。 2氧化苦参碱可通过抑制Th1类细胞分泌活性、促进Th2类细胞因子的分泌,尤其是IL-10,而达到保护肝细胞的作用。但在早期可能由于激活巨噬细胞(分泌IL-1)而加重肝损伤。 3脾脏通过Th1/Th2类细胞因子的分泌对急性免疫性肝损伤起到免疫调控作用。