BMSCs移植对PD大鼠脑纹状体内DA水平及AADC表达影响的研究

多巴胺(DA)作为去甲肾上腺素(NE)的前体物质,是中枢神经系统的关键递质。其通过选择性作用于抑制性神经元,维持机体运动平衡。若多巴胺合成不足,兴奋性胆碱能神经元将会处于相对优势,从而引发帕金森病(PD)。目前在PD的临床治疗方案中,普遍以补充DA类药物或恢复脑内DA水平来控制病情。因此,DA的水平及参与其合成的相关因子的表达在帕金森疾病发病机理及控制研究中起到重要作用。本研究对不同阶段大鼠脑纹状体内多巴胺的含量,以及芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因、蛋白表达的变化进行检测,通过分析骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗PD模型大鼠前后脑纹状体内DA和AADC含量的动态变化,探究外源性细胞移植治疗PD的作用机制,为PD的临床治疗提供实验依据。实验一BMSCs移植对PD模型大鼠脑纹状体DA水平影响的研究采用脑立体定位法单侧单点进针注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备PD大鼠模型,术后以经典的阿扑吗啡(APO)诱导大鼠转圈,筛选成功的PD模型大鼠。以全骨髓贴壁法培养取自正常大鼠股骨的骨髓间充质干细胞(BMSCs),纯化培养至第三代,原位定点移植到PD模型大鼠损毁侧纹状体内进行细胞治疗。术后APO诱导治疗后的大鼠,检测细胞移植对PD模型大鼠的行为学改善情况,判断细胞移植的治疗效果。通过紫外检测法检测梯度浓度的DA标准品确定标准曲线,建立脑纹状体组织中多巴胺含量的高效液相色谱(HPLC)测定方法。选取正常大鼠(N组)、造模后4周大鼠(M4组)、造模后8周大鼠(M8组)、BMSCs移植治疗后4周PD大鼠(T4组)、BMSCs移植治疗后8周PD大鼠(T8组)脑纹状体匀浆液,以HPLC检测各组动物纹状体内DA含量,探讨BMSCs移植治疗后脑纹状体内DA变化规律。成功PD模型大鼠的转圈数为8.47±1.12r/min。BMSCs移植治疗后,转圈数逐渐减少,8周时降至6.49±0.46r/min,与PD模型对照大鼠存在显著差异(P<0.05)。实验成功建立了HPLC检测色谱条件,即Waters SymmrtryshieldTM RP18柱,流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钠-0.02 mol/L柠檬酸-甲醇(74：24：2),流速为1.0 mL/min,外标法定量,紫外吸收波长λmax为280 nm；通过对标准品的测定,以多巴胺浓度(X)为横坐标,以多巴胺标准品色谱峰峰面积(Y)为纵坐标,进行回归计算,获取标准曲线为y=16.343x.0812,其相关系数R2=0.9996,具有较好的相关性；平均回收率分别为90.4%,91.1%,93.2%；RSD分别为3.4%,8.1%,5%；检测限为0.5 mg/L,定量限为10.8 mg/L,符合生物样品前处理的要求。以建立的HPLC方法对样品的检测结果显示,N组大鼠脑纹状体内DA的含量为15.56±2.16 μg/g；M4组、M8组大鼠损毁侧脑纹状体内DA含量分别为10.67±1.54 μg/g和10.50±2.32 μg/g,M4组与M8之间不存在差异(P>0.05),而M4组、M8组均极显著低于N组(P<0.01)；T4组与T8组大鼠损毁侧脑纹状体内DA含量分别为12.70±2.91 μg/g和13.71±2.42 μg/g,其中T4组显著高于M4组、M8组(P<0.05),T8组极显著高于M4组、M8组(P<0.01),表现出随细胞移植时间的延长DA水平逐渐恢复的趋势。研究显示,BMSCs移植治疗技术对PD模型大鼠的行为改善起明显作用,且能提高脑纹状体内DA的含量。提示移植的外源BMSCs,可能通过分化为多巴胺能神经元或促进其功能恢复、增加DA的分泌,进而改善PD模型的症状。实验二BMSCs对PD模型大鼠脑纹状体AADC表达影响的研究本研究通过检测多巴胺合成途径的限速酶—芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)的表达,探究BMSCs移植治疗PD中引起DA含量变化的作用途径。实验分别提取正常大鼠(N组)、PD模型大鼠(M组)和BMSCs移植治疗大鼠(T组)脑纹状体的总RNA、miRNA和总蛋白,以荧光定量PCR、Western Blot和免疫组化等方法检测脑纹状体内AADC的mRNA、 miRNA和蛋白,分析PD模型大鼠治疗前后AADC的mRNA、miRNA表达水平变化与蛋白水平变化的关系,同时结合纹状体内DA水平,分析BMSCs移植治疗PD大鼠的行为学改善与脑纹状体内多巴胺含量及其合成限速酶的关系。结果显示,正常大鼠(N组)、模型4周大鼠(M4组)、模型8周大鼠(M8组)、治疗4大鼠(T4组)和治疗8周大鼠(T8组)损毁侧脑纹状体内AADC mRNA的表达水平均不存在显著差异(P>0.05)。模型大鼠损毁侧脑纹状体内miRNA的表达水平显著高于正常鼠(P<0.01),AADC蛋白含量极显著降低于正常鼠(P<0.01);BMSCs移植治疗后,miRNA的表达极显著降低(P<0.01),AADC蛋白表达却上升。本实验中,AADC蛋白表达与miRNA趋势相反,提示AADC蛋白的表达可能在转录后受到niRNA的调控。免疫组化结果显示,模型组较正常组AADC特异性染色细胞减少,而BMSCs移植治疗后明显增多。本实验中,PD模型大鼠损毁侧脑中AADC蛋白较正常侧明显降低,移植BMSCs治疗后,AADC蛋白含量有所上升,相应的DA含量也同步提高。结果提示,纹状体内DA的合成受AADC的调控；BMSCs移植治疗,通过增加AADC的表达和AADC特异性染色细胞的数量,促进DA合成、提高DA水平,进而改善PD的症状。因此,AADC是保证DA合成的关键物质,其是PD发病与治疗的重要因子。