化浊解毒法对肝纤维化大鼠TGF-β/Smad信号转导通路的影响

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是指肝细胞发生坏死或炎症刺激时,肝脏内纤维结缔组织增生与分解失衡,从而在肝内异常沉积的病理过程,是多种慢性肝病的重要病理特征和发展至肝硬化的必经阶段。2006年美国第三届肝纤维化专题会议明确了肝纤维化是可逆的。Hans Popper教授说:“谁能阻止或延缓肝纤维化,谁将能医治大多数慢性肝病”。 肝纤维化发生的关键是肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活及其激活后细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)异常表达。从细胞因子及其信号转导角度研究药物的干预机制,有利于促进HF治疗学研究。转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1-1,TGF-β1)是最重要的促肝纤维化细胞因子之一,具有抑制肝细胞增殖、诱导肝细胞凋亡,激活HSC、促进其产生ECM等作用,TGFβ/Smad信号转导通路是TGFβ发挥这些生物效应重要的信号转导通路。 目前临床仍缺乏高效、无明显毒副作用的治疗HF的西药。中医药通过多途径、多环节、多靶点的综合药理学作用在抗HF方面展现出优势,显示了良好的前景。李佃贵教授经过多年的临床实践和基础研究,结合当今疾病模式及疾病谱的变化,提出以“浊毒”立论治疗肝纤维化的理论,并应用化浊解毒调肝法进行治疗,取得较好疗效。依据此理论确立的肝复健方能显著改善HF、慢性肝炎患者临床症状,促进HF指标的恢复;肝复健方能明显改善HF模型大鼠肝功能、抑制肝纤维化大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C、PCIII水平,抑制胶原纤维增生等作用。本课题以肝纤维化大鼠模型,以秋水仙碱为对照,观察肝复健方对HF大鼠肝脏TGF-β1及其受体、Smad2/3、Smad4、Smda7的表达情况,探讨其对TGF-β/Smad信号传导通路的影响,旨在对本方抗HF的药效和可能的作用机制作进一步的研究,为其临床应用提供实验依据。本实验分为以下五部分: 第一部分浊毒理论与肝纤维化 目的:以浊毒理论为依据探讨其在肝纤维化治疗中的地位,进而提出新的观点与治疗方法。 方法:温习、回顾了中医理论中浊毒源流,提出浊毒相关为害是肝纤维化的主病机,系统总结了肝纤维化浊毒特性的临床表现、基本治法、用药规律及兼夹证的治疗。 结果:梳理了浊毒之源流,探讨了肝纤维化与浊毒的关系,以及化浊解毒调肝法提出的理论依据,从临床论证了化浊解毒调肝方药治疗肝纤维化的可行性。 结论:浊毒是肝纤维化形成和进展过程中重要的始动因素和关键环节,临床上应用化浊解毒法不仅能改善其症状,还可恢复肝脏生理特性,截断或逆转肝脏病理性改变。 第二部分肝复健方对肝纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响 目的:将肝复健方应用于造模成功的HF大鼠,观察肝复健方对HF大鼠一般情况和病理组织学的影响。 方法:健康雄性SD大鼠60只,适应性喂养一周,随机分为正常组(Normal)10只,造模组50只。除正常组外,造模组采用腹腔注射未灭活猪血清法造模,每只大鼠每次注射猪血清0.5 ml,每周2次,共8周。造模成功大鼠分为:模型组,肝复健方小剂量组(以下简称GFJL),肝复健方中剂量组(以下简称GFJM),肝复健方大剂量组(以下简称GFJH),秋水仙碱组,每组均10只。GFJL给予含1.5 g生药/ml水煎剂2ml灌胃;GFJM给予含2.25 g生药/ml水煎剂2ml灌胃;GFJH给予含3.0 g生药/ml水煎剂2ml灌胃;秋水仙碱组给予0.154 g/kg·d灌胃;空白组、模型组均给予等量生理盐水灌胃。各组均灌胃至12周末。造模用药期间观察大鼠一般情况。于12周结束时,断颈处死各组大鼠,留取大鼠肝组织,采用苏木精-伊红染色(HE染色)和Masson染色(胶原纤维特殊染色法)观察肝组织病理形态学改变并进行大鼠肝纤维化病变半定量分析。 结果: 1一般情况观察 肝复健方可明显改善HF大鼠的精神状态、饮食、皮毛色泽,增加其体重。 2肝脏大体形态观察 正常组大鼠肝脏质地柔软,表面光滑。模型组大鼠肝脏质地坚韧,表面粗糙,颜色晦暗,有些可见颗粒状的小结节。秋水仙碱组及肝复健方药物治疗组大鼠肝表面较模型组光滑,质地较柔软。 3肝复健方对肝纤维化大鼠肝组织病理的影响 正常组肝小叶结构完整,肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列,无变性坏死,无纤维组织增生。模型组肝小叶结构严重破坏,肝细胞广泛坏死伴炎性细胞浸润,纤维组织大量增生并形成纤维间隔。与模型组比较,各药物治疗组肝小叶结构破坏明显减轻,肝脏胶原纤维增生亦明显减轻,纤维条索疏松变窄。肝细胞水肿好转,变性情况明显改善,炎细胞浸润减少。其中肝复健方高、中剂量组肝脏结构改善较为明显。 4大鼠肝纤维化病变半定量分析 按肝纤维化病变半定量分析判断标准的计分标准,正常组大鼠纤维化程度为0,模型组大鼠纤维化程度为(15.76±0.33),秋水仙碱组大鼠纤维化程度为(5.46±0.20),GFJL大鼠纤维化程度为(11.54±0.36),GFJM大鼠纤维化程度为(9.6±0.16),GFJH大鼠纤维化程度为(5.2±0.12)。与模型组比较,秋水仙碱组、GFJL、GFJM、GFJH大鼠纤维化程度均明显减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论:肝复健方能改善HF大鼠一般状况,能显著减轻大鼠肝组织炎症活动度及纤维化程度,体现出较强的保肝、抗HF作用。 第三部分肝复健方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1的影响 目的:探讨肝复健方对HF大鼠TGF-β1的影响。方法:免疫组织化学法和RT-PCR法分别检测HF大鼠肝组织TGF-β1的表达。 结果: 1肝复健方对大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达的影响 正常肝组织中TGF-β1蛋白微弱表达,显色极淡。模型组较正常组TGF-β1阳性信号明显增强;不同剂量肝复健方组TGF-β1蛋白的表达较模型组明显减少(p<0.05),GFJH作用最为明显;秋水仙碱组TGF-β1蛋白的表达较模型组降低(p<0.05)。 2肝复健方对大鼠肝组织TGF-β1mRNA表达的影响 与正常对照组相比,模型组、秋水仙碱组和肝复健方大、中、小剂量组TGF-β1mRNA的表达均明显增强,差异有统计学意义(p<0.05)。与模型对照组相比,秋水仙碱组和肝复健方大、中、小剂量组TGF-β1mRNA表达明显减弱,差异有统计学意义(p<0.05)。且肝复健方大、中剂量组优于秋水仙碱组(p<0.05)。 结论:肝复健方可能通过降低肝组织TGF-β1蛋白及基因的表达而达到抗纤维化的作用。 第四部分肝复健方对肝纤维化大鼠肝组织TβRI、TβRII的影响 目的:探讨肝复健方对HF大鼠TβRI、TβRII表达的影响。方法:免疫组织化学法和RT-PCR法分别检测HF大鼠肝组织TβRI、TβRII的表达。 结果: 1肝复健方对大鼠肝组织TβRI、TβRII蛋白表达的影响 正常对照组肝细胞和间质细胞可见TβRI和TβRII阳性染色,模型组TβRI和TβRII阳性染色显著增强(P<0.05),尤以纤维增生组织和炎性细胞周围多见。与正常组相比,模型组和各治疗组表达明显升高(P<0.05),而与模型组比较,秋水仙碱组和肝复健方各剂量组大鼠肝组织TβRI和TβRII表达则明显降低(P<0.05);各治疗组比较,肝复健方大、中剂量组优于秋水仙碱组(P<0.05)。 2肝复健方对大鼠肝组织TβRI、TβRII mRNA表达的影响 与正常对照组相比,模型对照组、秋水仙碱组和肝复健方大、中、小剂量组TβRI和TβRIImRNA的表达均明显增强,差异有统计学意义(p<0.05)。与模型对照组相比,秋水仙碱组和肝复健方大、中、小剂量组TβRI和TβRIImRNA表达明显减弱,差异有统计学意义(p<0.05)。且肝复健方大、中剂量组优于秋水仙碱组(p<0.05)。 结论:肝复健方能够显著抑制HF大鼠肝组织TβRI、TβRII型受体蛋白及基因的表达,从而抑制HF的发生、发展。 第五部分肝复健方对肝纤维化大鼠肝组织Smads表达的影响 目的:探讨肝复健方对Smad2/3,Smad4,Smad7蛋白表达的影响,结合二、三、四部分,观察其对TGF-β/samd信号通路的影响。 方法:Western blot检测HF大鼠肝组织Smad2/3,Smad4,Smad7的表达。 结果: 1肝复健方对大鼠肝组织Smad2/3、Smad4蛋白表达的影响(1)所有实验组大鼠肝组织中Smad2/3、Smad4的表达量均高于正常对照组(P<0.05);(2)肝复健方各剂量组及秋水仙碱组与模型组相比Smad2/3、Smad4的表达量有显著性降低(P<0.05);(3) GFJL与秋水仙碱组相比Smad2/3、Smad4表达量均无显著性差异(P>0.05);肝复健方中、大剂量组分别与秋水仙碱组相比Smad2/3、Smad4的表达量有显著性降低(P<0.05);(4)GFJH与GFJM相比Smad2/3、Smad4表达量有下降趋势,但无显著性差异(P>0.05)。 2肝复健方对大鼠肝组织Smad7蛋白表达的影响(1)所有实验组大鼠肝组织中Smad7的表达量均低于正常对照组(P<0.05)。(2)肝复健方各剂量组及秋水仙碱组与模型组相比Smad7的表达量显著升高(P<0.05)。(3)GFJL与秋水仙碱组相比Smad7表达量均无显著性差异(P>0.05);肝复健方中、大剂量组分别与秋水仙碱组相比Smad7的表达量显著升高(P<0.05)。(4)GFJH与GFJM相比Smad7表达量有上升趋势,但无显著性差异(P>0.05)。 结论:肝复健方能够抑制受体活化性蛋白smad2和smad3的表达,下调通用性蛋白Smad4的表达,促进抑制性蛋白Smad7的表达,抑制HF大鼠肝脏中TGF-β/smad信号传导通路的激活,从而抑制肝纤维化的发生和发展。