芍药苷对TLR2介导的炎症反应信号转导途径的影响

背景和目的: 脓毒症(sepsis)是感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome, SIRS)。是创伤、烧伤、休克、感染等临床急危重患者严重的并发症之一,也是诱发脓毒症休克(septic shock)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的重要原因。细菌感染时,机体的免疫系统能够识别侵入的微生物并产生快速的免疫应答,其识别系统由免疫细胞表面的一系列受体构成,这些受体被称为Toll样受体(TLR),由其介导的信号转导途径系统在炎症反应中起着重要的作用。TLRs可感知不同病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs),继而通过髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)、β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain containing adapter molecule inducing IFN-beta, TRIF)等连接蛋白引起下游的一系列炎症反应。TLR2感知细菌脂蛋白(Bacterial lipoprotein,BLP),能通过细胞内信号转导激活炎症反应,帮助消灭入侵的病原体,协调全身性防御。但如果炎症反应过度,则会造成器官功能的损害,导致多器官功能衰竭。 本课题组前期实验研究表明,给予小剂量BLP预刺激诱导免疫细胞产生耐受,然后再给予大剂量BLP刺激,结果显示产生耐受后的炎性细胞对再次大剂量BLP的刺激产生的细胞因子TNF-α的水平明显低于未耐受组,从而说明BLP耐受可抑制免疫细胞产生大量炎症因子,抑制过度的炎症反应。另外,封闭性抗TLR2抗体可减少BLP攻击THP-1细胞炎症因子的释放,可能对机体产生保护作用。但是,临床实践中我们很难预先给予小剂量病原体诱导耐受,而且目前,抗体制备技术尚不成熟且价格昂贵,很难在临床上推广使用。已有研究表明中药成分芍药苷(Paeoniflorin,Pae)具有抗炎及免疫调节等作用,但其在重症感染方面研究及应用很少,故本研究拟通过体外实验,观察芍药苷对BLP攻击THP-1细胞后其TLR2、MyD88及炎症因子的表达的影响,旨在观察芍药苷对受攻击THP-1细胞的抗炎作用,以及进一步探讨其相关机制。 方法: 1.实验采用人单核细胞系(THP-1)进行细胞培养,加入同一浓度BLP(1000ng/ml)分别培养1、2、4、6、8、12、24、36、48h,及将BLP刺激后的THP-1细胞与不同浓度Pae(10-8,10-7,10-6,10-5,10-4mol/L)分别作用4h和48h后,收集细胞上清,用酶联免疫吸附法(ELISA)分别测定TNF-α、IL-6的水平。 2. THP-1细胞与BLP(100ng/ml)及Pae(10-4mol/L)分别作用20分钟收集细胞,采用Western Blotting技术检测TLR2,MyD88及NF-κB的表达。 3.将THP-1细胞分为四组,空白对照组、BLP组(BLP 1000ng/ml)、Pae组(芍药苷10-4M)及BLP+Pae组(BLP 1000ng/ml +芍药苷10-4M),应用流式细胞技术检测各组细胞凋亡情况。 结果: 1.给予BLP(1000ng/ml)刺激后,细胞因子TNF-α及IL-6均有明显增加,TNF-α在4h达高峰,IL-6在24h后显著升高,48h达高峰。Pae体外作用可抑制BLP刺激后THP-1细胞表达TNF-α、IL-6的水平(bP<0.01),并呈浓度依赖性。 2. BLP(100ng/ml)在20min时即能上调THP-1细胞胞核NF-κB P65蛋白的表达,而芍药苷可明显下调P65蛋白的表达(P﹤0.05),与对照组相比,BLP组和BLP+Pae组的TLR2和MyD88表达均无统计学差异(P>0.05)。 3. BLP组(1000ng/ml)THP-1细胞凋亡率明显高于对照组(P﹤0.05), Pae(10-4M)与对照组之间比较,BLP组与BLP+Pae组比较,两组间均无统计学差异(P>0.05)。 结论: 1. BLP体外作用可升高THP-1细胞分泌TNF-α、IL-6的水平; 2.芍药苷体外作用可降低TNF-α、IL-6的产生水平。 3.芍药苷的抗炎作用可能是通过NF-κB途径实现的。