目的:通过制作SD大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,探讨淮山药灌胃预处理在预防和减轻肾脏缺血再灌注损伤和促进肾脏再生修复方面的作用。
方法:
1.选用60只3～4周龄雄性SD大鼠进行动物实验。实验动物造模前2周,所有SD大鼠腹腔内注射BrdU 100mg/kg体重,连续3天,然后随机分4组。正常对照组(N,n=6)大鼠常规麻醉后行剖腹手术,下腔静脉采血和收获肾脏标本;假手术组(SO,n=6)大鼠常规麻醉后行剖腹手术,游离双侧肾蒂血管后不作结扎,45min后采血和收获肾脏标本;缺血再灌注淮山药灌胃预处理组(I/R淮山药组,n=24)和缺血再灌注无菌生理盐水灌胃对照组(I/R生理盐水组,n=24)大鼠在常规麻醉后行剖腹手术,游离双侧肾蒂血管后用无损伤动脉夹阻断双肾血流45min后,恢复血流、关闭腹腔。分别于再灌注2h、12h、24h、48h四个时间点随机选I/R淮山药组和I/R生理盐水组各6只大鼠进行下腔静脉采血和收获肾脏标本。动物造模前5天:I/R淮山药组SD大鼠,用淮山药10g/kg体重灌胃,连续5天;I/R生理盐水组SD大鼠,用无菌生理盐水作为安慰剂灌胃,连续5天。
2.各组实验动物血清标本应用全自动生化分析仪测定BUN、Scr,了解肾功能;MDA试剂盒TBA法检测血清MDA值;肾脏标本常规病理切片,H-E染色观察肾组织损伤程度;TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组织化学S-P法检测细胞增殖情况,并在激光共聚焦显微镜下观察肾内BrdU阳性细胞和Pax-2阳性细胞分布情况;RT-PCR检测HGF、C-met、BMP-7、Pax-2基因表达情况。
主要结果:
1.肾组织损伤情况:I/R淮山药组大鼠肾脏缺血45min再灌注12h、24h、48h,组织学评分值分别为7.50±0.55、6.17±0.75、4.17±0.75,较I/R生理盐水组(分别为:8.50±0.55、7.00±0.89、5.17±0.98)明显减低,有显著性统计学差异(P﹤0.05)。在再灌注12h和24h时,两组大鼠肾小管损伤最为明显,其组织学评分较SO组(0.67±0.52)明显增高,有显著性统计学差异(P﹤0.01)。
2.肾功能情况:N组Scr、BUN水平分别为23.95±3.20μmol/L、5.79±0.54mmol/L,与SO组(分别为:25.12±3.95μmol/L、6.15±0.40mmol/L)比较,均无明显差异(P﹥0.05);肾脏缺血再灌注损伤后各组Scr、BUN水平均有上升,于再灌注后12h和24h最为明显;再灌注后2h、12h、24h、48h,I/R淮山药组Scr值分别为34.23±5.08μmol/L、56.38±8.70μmol/L、81.53±10.17μmol/L、55.01±9.71μmol/L,与同时间点I/R生理盐水组(46.8±3.69μmol/L、98.70±12.37μmol/L、128.5±17.30μmol/L、80.72±11.13μmol/L)比较,有明显降低(P﹤0.05);12h、24h、48h,I/R淮山药组的BUN值分别为15.3±2.60mmol/L、19.56±3.89mmol/L、14.72±2.99mmol/L,与同时间点I/R生理盐水组(22.07±4.57mmol/L、34.75±6.32mmol/L、20.16±2.40mmol/L)比较,有明显降低(P﹤0.05)。
3.组织氧化损伤和细胞凋亡情况:SO组大鼠血清MDA水平为3.65±0.98nmol/ml与N组(3.70±0.70nmol/ml)比较,无显著性统计学差别(P﹥0.05)。再灌注2h、12h、24h,I/R淮山药组大鼠血清MDA值分别为4.74±0.50nmol/ml、6.19±0.68nmol/ml、5.16±0.58nmol/ml ,与I/R理盐水组( 7.45±1.03nmol/ml、10.52±1.57nmol/ml、6.93±1.32nmol/ml)比较,峰值明显降低(P﹤0.05)。再灌注48h,I/R淮山药组的血清MDA值为5.05±0.70nmol/ml,与I/R理盐水组(5.89±1.21nmol/ml)比较,无显著性统计学差异(P﹥0.05)。肾脏再灌注2h就有凋亡细胞出现,12h时可见大量凋亡细胞脱落到肾小管腔中。再灌注12h时, I/R淮山药组凋亡细胞数为10.17±2.14/HP,较I/R生理盐水组(13.67±2.94/HP)明显减少,有显著性统计学差异(P﹤0.05)。
4.细胞增殖和BrdU阳性细胞分布情况:肾缺血再灌注损伤后可见PCNA阳性细胞,且主要位于肾小管。在再灌注后2h、12h、24h、48h,I/R淮山药组PCNA阳性细胞数分别为2.67±1.21/HP、9.50±1.87/HP、14.83±2.71/HP、10.83±2.04/HP,较I/R生理盐水组(1.83±0.75/HP、7.00±1.41/HP、11.33±1.75/HP、8.50±1.05/HP)明显增多,有显著性统计学差异(P﹤0.05)。SO组大鼠肾乳头区有大量BrdU阳性细胞,很少位于肾小管壁,在再灌注后48h I/R淮山药组大鼠肾乳头区BrdU阳性细胞有较明显的减少,而肾小管壁可见较多的BrdU阳性细胞;在再灌注后24h,I/R淮山药组BrdU阳性细胞数为13.17±3.19/HP,较I/R生理盐水组(8.33±2.16/HP)和SO组(1.17±0.75/HP)均有明显增加(P﹤0.05)。
5.相关基因表达情况:
(1)缺血再灌注损伤后12h、24h, I/R淮山药组大鼠肾脏HGF mRNA相对表达量分别为0.51±0.10、0.46±0.09,与I/R生理盐水组(0.36±0.02、0.31±0.15)和SO组(0.28±0.05)相比有上调(P﹤0.05);缺血再灌注损伤后12h、24h I/R淮山药组大鼠肾脏C-met mRNA相对表达量分别为1.22±0.28、0.46±0.09,与I/R生理盐水组(0.86±0.08、0.31±0.15)相比有上调(P﹤0.05)。
(2)BMP-7 mRNA在肾缺血再灌注损伤后开始的表达是下调的,于12h时开始上调,在再灌注损伤24h最为显著。再灌注后12h,I/R淮山药组大鼠肾脏BMP-7 mRNA相对表达量为0.6±0.09,与I/R生理盐水组(0.39±0.08)和SO组(0.42±0.07)相比有明显上调(P﹤0.05)。
(3)Pax-2 mRNA在N组、SO组肾脏组织中均未见明显表达,肾缺血再灌注损伤12h后,I/R淮山药组和I/R生理盐水组大鼠肾脏Pax-2 mRNA开始有表达。同样在激光共聚焦显微镜下观察,N组、SO组大鼠肾小管壁中均未见Pax-2阳性细胞;肾缺血再灌注损伤12h时I/R淮山药组肾小管出现Pax-2阳性细胞,于再灌注后24h时I/R淮山药组可见Pax-2、BrdU双阳性标记细胞位于肾小管壁。
主要结论:
1.缺血再灌注可引起明显的肾脏组织结构损伤和功能损害,淮山药灌胃预处可以减轻氧化损伤和减少细胞凋亡的发生,降低了血清Scr、BUN和MDA水平,从而有效地保护了肾功能。
2.淮山药灌胃预处理,提高了肾组织HGF、C-met和BMP-7基因的表达水平,调节和改善了肾脏局部微环境,从而促进了受损的肾小管细胞的再生修复和肾小管的重建。
3.肾缺血再灌注损伤后,肾内BrdU持续标记的细胞参与了肾脏损伤后的再生修复过程,且一部分BrdU阳性细胞同时表达了正常情况下成体肾脏不表达的Pax-2基因。Pax-2和BrdU双阳性标记细胞可能是肾内固有的祖细胞,肾乳头区可能是肾内干细胞存在的微生态环境,即壁龛。
