逍遥散调控海马β-arrestin2介导的信号通路改善肝郁证的机制研究

背景：肝郁证即肝气郁结证,是指肝气疏泄不及而产生的以气机郁滞为特点的证候,它属于中医“郁证”的一种证型。《内经》中首次提出“郁”的概念,后世医家又提出了五郁、六郁学说。肝郁,则是由五郁、六郁、情志致郁等逐渐演化过来的,将五气之郁与脏腑之郁联系起来。近年临床流行病学资料显示,在五脏病证中,中医肝脏病证占总体病证的40%,而肝郁证作为肝脏病证的基本病理变化,可见于临床各种疾病的初起阶段。因此肝郁证一直是近年来中医领域研究的热点。肝郁证的研究分临床研究和动物实验研究,在其本质研究方面,因许多临床样本的不可获取性,动物研究更具优势。中医证候动物模型的建立是中医现代化研究的重要方法。在多种模型复制方法中,慢性不可预知温和刺激法(chronic unexpected mild stress, CUMS)在国内外的认可度最高,它可以诱导动物的肝郁证表现,其应激因子的多样性、温和性和不可预知性很好地模拟了人类肝郁证的病因,且不会造成动物的躯体损害。肝郁证的方证研究也是其本质研究的重要方面。“方从法出,法随证立”,辨证论治是中医的核心。中医证候研究具有以证选方、以方测证、方证互参的特点,通过这一特点,我们可以通过观察某一证型在相应方药治疗前后临床症状的改善来反证辨证的准确性。近年来对肝郁证本质的研究颇多,已初步证实肝郁证具有现代病理生理学基础,认为肝郁证是在抑郁、焦虑等不良心理应激状态下,出现高级神经中枢调节功能的紊乱,进而影响到神经、免疫、消化、运动、感觉等多系统而出现的病理改变和病证表现。近年来对应激相关的下丘脑-垂体-肾上腺素皮质系统和海马突触可塑性变化的研究较多,说明海马在肝郁证的发病中起着重要作用。中医证候是疾病发生和演变的过程中,某一阶段中患者机体当时所处的特定内外环境的本质反映。证候研究是中医理论研究的一个关键问题,证候作为一种规律的病理表现,必然存在其相应的物质基础,但中医证候错综复杂,如何运用现代科学的方法来揭示其本质是其研究的关键点。近年来,一门新兴的学科-蛋白质组学的出现为解决这一问题提供了一种新方法。蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质表达方式和功能方式的一门学科,它从整体水平上来认识生命现象,与中医学的“整体观念”类似。细胞内的蛋白质不是一成不变的,蛋白质组作为所有蛋白质的整合,也是不断变化的。而中医证候在疾病不同阶段的病机和表现也是不同的,存在一定的演变规律,这些变化的物质基础可能就反应在蛋白质组的水平。将蛋白质组学应用于中医证候的研究中,不仅可以反应不同症状的物质基础,又可以了解不同蛋白质组分在证的演变过程中发生的变异,通过对证候演变前后的蛋白质组学研究对比来探究中医证候的物质基础变化机制,揭示中医证候的内涵,可以为中医的客观化道路打下基础。因此,本研究拟以海马组织作为切入点,提取其磷酸化蛋白质,通过蛋白质组学方法进行差异蛋白质的鉴定分析。并根据该蛋白分析结果的提示,引出肝郁证的关键信号分子及其介导的信号通路,进行更深入的研究。同时选用中医经典抗肝郁方逍遥散进行干预,并以临床经典抗抑郁药氟西汀(研究表明其可有效改善闷闷不乐,兴趣减退等肝郁证症状)作为阳性对照药,以期对海马在肝郁证发病机制中的作用提供更进一步的证据,为继续深入研究肝郁证的本质奠定基础。目的：采用CUMS联合孤养的方法复制肝郁证大鼠模型,通过观察模型大鼠的一般状态、糖水消耗率及行为学指标等评价模型的成功与否。然后用蛋白质组学的方法,对肝郁证模型大鼠海马磷酸化蛋白质进行差异表达分析,并根据分析结果的提示引出肝郁证的关键信号分子及其介导的信号通路并进一步研究。试图借助肝郁证大鼠模型,利用蛋白质组学的方法找到肝郁证相关的特异性蛋白质,为中医证候理论的研究找到相应的物质基础,也可为肝郁证的临床治疗提供新思路,有望发现其治疗的新靶点。并通过逍遥散和氟西汀对模型大鼠进行干预,发现其蛋白表达水平的差异,探讨逍遥散改善肝郁证的作用机理,并利用中医证候“以方测证,方证互参”的特点,为肝郁证的本质研究及治疗提供新思路和新方法。方法：本研究在中医证候理论指导下通过CUMS联合孤养的方法复制肝郁证大鼠模型,采用中药复方逍遥散进行干预,并应用蛋白质组学的方法,以海马组织为研究对象,找出模型组大鼠与对照组及逍遥散组大鼠海马组织的差异表达蛋白点,通过鉴定分析并引出肝郁证的关键信号分子及其介导的信号通路,采用免疫组化(Immunohistochemical, IHC)、免疫印迹(Western blot, WB)及荧光定量PCR (real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)技术进一步研究。1、CUMS联合孤养的方法复制肝郁证大鼠模型动物分组及模型复制：清洁级雄性SD大鼠40只,体重200±20g,适应性饲养一周后随机分为对照组、模型组、模型加逍遥散组(简称逍遥散组)、模型加氟西汀组(简称氟西汀组),每组10只。对照组5只一笼,其余三组单笼饲养,并接受CUMS程序干预,一周内刺激方式随机使用,连续三周。药物干预：逍遥散组给予19 g/kg/d的逍遥散溶液,氟西汀组给予2 mg/kg/d的氟西汀混悬液,对照组和模型组均给予蒸馏水,按照10ml/kg灌胃,药物总量按一日两次分服。模型评价：通过对大鼠一般状态的观察、糖水消耗率及行为学检测等判断模型的可靠性。2、运用HE染色和尼氏染色,观察大鼠海马组织的形态学变化。3、海马磷酸化蛋白质的2-DE分离及凝胶图像优化海马磷酸化蛋白质的2-DE分离,对同类混合样本以组间配对的形式,同时进行2-DE分离,并重复3次。2-DE分离获得的凝胶,经处理后扫描成图像。用PDQuest7.0软件分析凝胶图像,获取每个蛋白质的表达量、等电点和分子量等信息。并将组间表达量相差2倍以上的蛋白质斑点设定为差异表达蛋白质,由软件自动生成分析结果,再结合人工验证。4、差异表达蛋白质斑点的质谱鉴定和数据库确认用结合基质辅助激光解吸电飞行时间质谱技术(matrix assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry, MALDI-OF-MS)对差异蛋白质斑点进行肽质量指纹(peptide mass fingerprint, PMF)检测。根据http://www.uniprot.org/上的蛋白质数据库检索最终确定结果蛋白质。5、用WB、IHC和酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)等方法检测海马中β-arrestin2和CRHR蛋白表达及相关激素的变化情况。6、用WB和RT-PCR法检测海马中β-arrestin 2 介导的 PP2A-Akt-mTOR信号通路的表达情况。7、用WB和IHC法检测海马中β-arrestin2介导的ERK-BDNF信号通路的表达情况。8、统计学方法实验结果均采用平均值±标准差(X±S)的形式表示,SPSS 13.0软件统计包用于数据处理。大鼠每周的体重情况采用重复测量数据的方差分析,其余的指标,多样本的均数比较均采用单因素方差分析,若方差齐,多重比较采用LSD法检验,若方差不齐,则采用Welch分析,多重比较采用Games-Howell法检验。同组动物造模前后的均数比较采用配对样本的t检验。所有的检验方法均以P<0.05作为具有显著性差异。结果：1、采用CUMS联合孤养的方法成功复制了肝郁证大鼠模型。造模3周后,从一般状态来看,造模初期,模型组大鼠表现为焦虑、烦躁、挣扎,随后逐渐麻木,出现行动迟缓、躲在角落、食欲减退、皮毛无光泽、便溏等肝郁证表现。逍遥散组和氟西汀组上述表现较轻,且各种症状的发展变化相对缓慢。对照组则一直活泼好动,未见异常行为状态。各组间体重增长具有显著性差异,模型组体重最低,逍遥散组和氟西汀组体重则高于模型组,而对照组大鼠体重则一直处于稳步增长中,体重最高。旷场实验发现模型组大鼠的直立数和爬格数均显著低于对照组,逍遥散组对其直立数和爬格数均有提高,氟西汀组则仅对爬格数有所提高。糖水消耗实验提示各组大鼠糖水消耗率具有显著性差异,模型组的糖水消耗率低于其他组。食物消耗实验提示,模型组和两药物组食物消耗量均显著低于对照组,但逍遥散组食物消耗量高于模型组,而氟西汀组则与模型组无显著性差异。2、HE染色发现模型组神经元缩小,细胞形态改变为不规则形,逍遥散组和氟西汀组神经元改变则较模型组改善,尼氏染色发现模型组尼氏体数量减少,而逍遥散组和氟西汀组的尼氏体数量则较模型组增加。3、获得了高质量的海马组织磷酸化蛋白质的2-DE图像,发现了10个肝郁证大鼠的差异蛋白,其中2个在模型组表达下调,8个表达上调,并鉴定出了蛋白的相关信息。4、β-arrestin 2和CRHR蛋白表达及相关激素的检测结果发现：模型大鼠海马的P-arrestin2蛋白表达较对照组下降,CRHR2蛋白表达则上调,而逍遥散和氟西汀使其表达水平得到恢复。CRHR1蛋白表达则无显著性差异。血清激素检测,ACTH和CRH的浓度在各组大鼠间无显著性差异,而模型组大鼠的CORT和Urocortin-2的浓度高于对照组,具有显著性差异,而逍遥散组和氟西汀组CORT和Urocortin-2浓度则较模型组降低。脑脊液激素检测,CRH浓度在各组大鼠间无显著性差异,模型组Urocortin-2浓度高于对照组,具有显著性差异。5、β-arrestin2介导的PP2A-Akt-mTOR信号通路研究发现：各组大鼠PP2A c、mTPR、Akt蛋白的表达无显著性差异,而PP2A b、p-mTOR和p-Akt蛋白的表达则具有显著性差异。其中PP2A b蛋白在模型组表达水平较对照组升高,而逍遥散组和氟西汀组的表达水平较模型组降低,p-mTOR和p-Akt蛋白在模型组表达水平较对照组降低,而逍遥散组和氟西汀组的表达水平较模型组升高。PP2Ac mRNA表达在各组间无统计学意义,PP2A b mRNA的表达结果同PP2Ab蛋白表达情况。6、β-arrestin2介导的ERK-BDNF信号通路研究发现：各组大鼠ERK蛋白的表达无统计学意义,而p-ERK、BDNF 和 TrkB蛋白的表达则具有显著性差异。这三个蛋白在模型组表达水平均较对照组降低,而逍遥散组和氟西汀组的表达水平较模型组升高。结论：通过对CUMS联合孤养复制的肝郁证大鼠模型海马组织磷酸化蛋白质的蛋白质组学研究,发现了10个肝郁证大鼠的差异蛋白并鉴定出了蛋白的相关信息。并根据差异蛋白分析结果引出了肝郁证的关键信号分子β-arrestin 2,并研究了CRHR表达与相关激素的变化情况,以及其介导的PP2A-Akt-mTOR和ERK-BDNF信号通路。结果提示β-arrestin 2通过对CRHR2表达及Urocortin-2、 CORT浓度的影响,及介导PP2A-Akt-mTOR、ERK-BDNF信号通路改变引起大鼠海马突触可塑性的改变,导致肝郁证。而逍遥散可以通过调控海马β-arrestin2介导的信号通路来改善肝郁证。本研究以前期蛋白质组学结果作为切入点,提出β-arrestin 2是介导PP2A-Akt-mTOR, ERK-BDNF信号通路、调控肝郁海马可塑性的关键分子,是肝郁证形成的新靶标,具有原始创新。