REM睡眠剥夺对大鼠空间记忆、海马CaN的影响及FK506的干预作用研究

第一部分REM睡眠剥夺与恢复对大鼠空间记忆及海马CaN的影响 【目的】观察不同时间REM睡眠剥夺与恢复对大鼠空间记忆、海马内钙调神经磷酸酶(CaN)活性及表达量的影响。探讨REM睡眠剥夺导致的大鼠认知功能障碍与海马CaN的活性及表达之间的联系以及睡眠恢复对认知功能的改善作用。 【方法】成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组(CC)、环境对照组(TC)、REM睡眠剥夺组(SD)及REM睡眠剥夺后睡眠恢复组(SR),每组分为1天、3天、5天组,其中REM睡眠剥夺组分为剥夺1天组(SD1)、3天组(SD3)、5天组(SD5),睡眠恢复组分为剥夺1天后睡眠恢复6小时组(SR1)、剥夺3天后睡眠恢复18小时组(SR3)、剥夺5天后睡眠恢复30小时组(SR5)。选用Morris水迷宫对所有大鼠进行空间认知功能的训练(定位航行实验),训练完成后采用改良多平台水环境睡眠剥夺法(MMPM)建立大鼠的REM睡眠剥夺模型,完成相应时间的REM睡眠剥夺及睡眠恢复后,利用Morris水迷宫的空间搜索实验测定大鼠的空间记忆。运用比色法酶活性测定、蛋白质免疫印迹技术(Western-blot)测定大鼠海马CaN酶活性及表达量的变化。 【结果】1.各组大鼠空间认知功能训练的潜伏期及游泳距离无明显差异(p>0.05);2.空间搜索实验指标(空间记忆):CC与TC无明显差异(p>0.05),CC1、TC1、SD1、SR1之间无明显差异(p>0.05),SD3、SD5较CC、TC明显降低(p<0.01),SR3较CC3、TC3、SD3无明显差异(p>0.05),SR5较CC5(p<0.01)、TC5(p<0.05)明显降低,而与SD5无明显差异(p>0.05),SD1较SD3(p<0.05)、SD5(p<0.01)明显升高;3.海马CaN酶活性:CC与TC无明显差异(p>0.05),CC1、TC1、SD1、SR1之间无明显差异(p>0.05),SD3较CC3、TC3、SR3明显升高(p<0.01),SR3较CC3、TC3无明显差异(p>0.05),SD5、SR5较CC5、TC5明显升高(p<0.01),而两者间无明显差异(p>0.05),SD3、SD5较SD1明显升高(p<0.01);4.海马CaN含量:各组间无明显差异(p>0.05)。 【结论】持续1天的REM睡眠剥夺对大鼠空间记忆、海马CaN影响不明显,随着REM睡眠剥夺时间的延长,大鼠空间记忆能力下降,伴随海马组织CaN活性升高,但海马CaN含量无明显变化,REM睡眠剥夺3天后睡眠恢复可改善大鼠空间记忆,同时降低海马CaN活性,而REM睡眠剥夺5天后睡眠恢复则无此作用。REM睡眠剥夺后海马CaN活性的升高与大鼠空间记忆的损害有关联。 第二部分REM睡眠剥夺对大鼠空间记忆、海马CaN的影响及FK506的干预作用 【目的】观察不同时间REM睡眠剥夺过程中使用CaN抑制剂FK506干预,大鼠空间记忆、海马CaN活性及表达量的变化。探讨CaN在REM睡眠剥夺导致大鼠认知功能障碍中的作用,以及FK506干预作用的机制。 【方法】成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组(CC)、环境对照组(TC)、REM睡眠剥夺组(SD)、REM睡眠剥夺后睡眠恢复组(SR)、REM睡眠剥夺FK506大剂量干预组(10mg/kg,FH)、小剂量干预组(1mg/kg,FL)、溶剂对照组(SV)、雷帕霉素对照组(2mg/kg,RA),每组分为1天、3天、5天组,其中1天的正常组又分为正常对照组(CC)、FK506大剂量组(10mg/kg,CFH)、FK506小剂量组(1mg/kg,CFL)、溶剂对照组(CV),REM睡眠剥夺组分为剥夺1天组(SD1)、3天组(SD3)、5天组(SD5),睡眠恢复组分为剥夺1天后睡眠恢复6小时组(SR1)、剥夺3天后睡眠恢复18小时组(SR3)、剥夺5天后睡眠恢复30小时组(SR5)。选用Morris水迷宫对所有大鼠进行空间认知功能的训练(定位航行实验),训练完成后采用改良多平台水环境睡眠剥夺法(MMPM)建立大鼠的REM睡眠剥夺模型,同时给予相应的干预药物或溶剂,完成相应时间的REM睡眠剥夺及睡眠恢复后,利用Morris水迷宫的空间搜索实验测定大鼠的空间记忆。运用比色法酶活性测定、蛋白质免疫印迹(Western-blot)等方法测定大鼠海马CaN酶活性及含量的变化。 【结果】1.各组大鼠空间认知功能训练的潜伏期及游泳距离无明显差异(p>0.05);2.CC、CFH、CFL、CV组的空间记忆及海马CaN活性、含量无明显差异(p>0.05);3.空间搜索实验指标(空间记忆):CC与TC无明显差异(p>0.05),1天的各组之间无明显差异(p>0.05);CC3、TC3、FH3、FL3、SR3之间无明显差异(p>0.05),SR3、SD3、SV3、RA3之间无明显差异(p>0.05),SD3、SV3、RA3较CC3、TC3(p<0.01)及FH3(p<0.05)明显降低,FL3较SD3、SV3明显升高(p<0.05),而较RA3无明显差异(p>0.05);CC5、TC5、FH5之间无明显差异(p>0.05),SD5、SR5、FL5、SV5、RA5之间无明显差异(p>0.05),SD5、SV5、RA5较CC5、TC5(p<0.01)及FH5(p<0.05)明显降低,SR5、FL5较CC5(p<0.01)、TC5(p<0.05)明显降低,而较FH5无明显差异(p>0.05);4.海马CaN酶活性:CC与TC无明显差异(p>0.05),1天的各组之间无明显差异(p>0.05);CC3、TC3、FL3、SR3之间无明显差异(p>0.05),SD3、SV3、RA3较CC3、TC3、FH3、FL3、SR3明显升高(p<0.01),而三组间无明显差异(p>0.05),FH3较SR3明显降低(p<0.01),而较FL3无明显差异(p>0.05);CC5、TC5、FH5之间无明显差异(p>0.05),SD5、SV5、RA5、SR5、FL5较CC5、TC5明显升高(p<0.01),而五组之间无明显差异(p>0.05),FH5较SD5、SV5(p<0.01)及RA5、SR5(p<0.05)明显降低,而较FL5无明显差异(p>0.05);5.海马CaN含量:各组间无明显差异(p>0.05)。 【结论】FK506对正常及REM睡眠剥夺1天的大鼠认知功能及海马CaN无明显影响。随着REM睡眠剥夺时间的延长,FK506干预能改善大鼠空间记忆,降低海马CaN活性,而海马CaN含量无明显变化,REM睡眠剥夺3天时两种剂量FK506干预均有效,REM睡眠剥夺5天时仅大剂量FK506干预有效。FK506可能通过降低海马内CaN活性改善REM睡眠剥夺大鼠的空间记忆。 第三部分REM睡眠剥夺与恢复对大鼠海马STEP、ERK的影响及FK506的干预作用 【目的】观察不同时间REM睡眠剥夺与恢复对大鼠海马STEP(striatal enriched protein tyrosine phosphatase)及细胞外信号调节激酶(ERK)含量、活性的影响,REM睡眠剥夺过程中使用CaN抑制剂FK506干预后的相应变化。探讨REM睡眠剥夺后海马CaN活性升高导致大鼠认知功能障碍的机制,以及FK506的干预机制。 【方法】成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组(CC)、环境对照组(TC)、REM睡眠剥夺组(SD)、REM睡眠剥夺后睡眠恢复组(SR)、REM睡眠剥夺FK506干预组(10mg/kg,FH)、溶剂对照组(SV)、雷帕霉素对照组(2mg/kg,RA),每组分为3天、5天组,其中REM睡眠剥夺组分为剥夺3天组(SD3)、5天组(SD5),睡眠恢复组分为剥夺3天后睡眠恢复18小时组(SR3)、剥夺5天后睡眠恢复30小时组(SR5)。采用改良多平台水环境睡眠剥夺法(MMPM)建立大鼠的REM睡眠剥夺模型,同时给予相应的干预药物或溶剂,完成REM睡眠剥夺及睡眠恢复后,运用蛋白质免疫印迹技术(Western-blot)测定观察大鼠海马STEP、ERK含量及活性状态的变化。 【结果】1.海马STEP磷酸化水平:CC、TC、FH间无明显差异(p>0.05),SD3、SV3、RA3较CC3、TC3、SR3、FH3明显降低(p<0.01),三组间无明显差异(p>0.05),SR3较CC3(p<0.01)、FH3(p<0.05)明显降低,而较TC3无明显差异(p>0.05);SD5、SV5、RA5、SR5较CC5、TC5、FH5明显降低(p<0.01),而四组之间无明显差异(p>0.05);2.各组海马ERK2总含量无明显差异(p>0.05);3.海马ERK2磷酸化水平:CC、TC、FH无明显差异(p>0.05),SD、SV、RA无明显差异(p>0.05),均较CC、TC、FH明显降低(p<0.01);SR3较SD3、SV3、RA3明显升高(p<0.01),而与FH3无明显差异(p>0.05);SR5较SD5、SV5(p<0.01)、RA5(p<0.05)明显升高,而较CC5、TC5(p<0.01)、FH5(p<0.05)明显降低。 【结论】REM睡眠剥夺能导致大鼠海马内STEP磷酸化水平下降即活性升高,伴有ERK2磷酸化水平下降即活性下降,对ERK2总量无明显影响,而FK506干预能降低海马STEP活性,同时升高海马ERK2磷酸化水平,REM睡眠剥夺3天后睡眠恢复也有此效果。FK506干预通过调节海马STEP及ERK2活性,从而改善REM睡眠剥夺大鼠的空间记忆。