丹酚酸B的降解机理及纯化工艺研究

丹参是唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge．）的干燥根及根茎，是一味传统中药，《中华人民共和国药典》（2005版）记载丹参具有“祛瘀止痛，活血通经、清心除烦”等功效。丹酚酸B是丹参中含量最高的酚酸成分，有很强的生物活性，特别是在抗氧化、清除自由基方面具有很高的药用价值。但丹酚酸B不稳定，易降解，不仅降低制剂的临床疗效，也给丹酚酸B的临床应用带来安全隐患，已成为丹酚酸B产业化的瓶颈。本文以反应动力学和热力学为理论基础，运用HPLC、LC-MS和NMR等现代分析手段，系统研究了丹酚酸B的降解动力学特征和降解机理。在此基础上，对丹酚酸B的提取纯化工艺进行初步探索和优化。 首先，研究了丹酚酸的降解现象，并利用LC-MS对其中11种成分进行鉴定。实验结果表明，在加热过程中丹酚酸含量随加热时间延长不断变化，主要规律是丹酚酸A、B、E等缩合酚酸含量不断减少，丹参素、原儿茶醛、咖啡酸等含量不断增加，紫草酸及其同分异构体的含量先增加后减少，表现为中间产物的动力学行为。pH是影响缩合酚酸降解的主要因素，在pH2.0-3.0时缩合酚酸较为稳定，在其它pH条件下，缩合酚酸的降解速率明显增大，多酚酸相似的稳定性趋势是由相近的化学结构决定的。 其次，研究了缓冲盐浓度、溶液的pH、温度等对丹酚酸B降解的影响。实验结果表明，丹酚酸B降解符合一级动力学特征，降解速率随缓冲盐浓度的增加而线性增大。pH-速率图是“S”型曲线，在pH2.0时最为稳定；当pH＜2.0时，丹酚酸B降解速率随pH减小而加快，表明主要受到H+催化作用；当pH2.0-7.0时，丹酚酸B降解速率随pH增大而加快，表明受OH-催化作用。丹酚酸B的降解速率随温度升高而加快，Arrhenius公式拟合结果表明，在pH2.0-4.0条件下，丹酚酸B降解活化能是40-85kJ／mol，处在酯水解能量范围内。 再次，用HPLC制备了丹酚酸B的降解产物并进行了结构鉴定，得出了丹酚酸B的降解机理。1H(13C)-NMR鉴定结果表明，丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、紫草酸和丹酚酸E是丹酚酸B的主要降解产物。丹酚酸B主要降解途径是酯水解和苯并呋喃开环，其中丹参素、紫草酸是水解产物，原儿茶醛是氧化产物，丹酚酸E是苯并呋喃开环产物。 在此基础上，研究了微波干燥丹参鲜药材和丹酚酸B的提取、纯化工艺。 首先，以丹酚酸B的溶出速率为指标，首次考察了微波干燥丹参鲜药材结合冷浸提取提取丹酚酸B的工艺。结果表明，微波干燥的最佳功率为650W，与晒干药材相比，微波干燥药材中丹酚酸B的溶出速率可提高117％，并获得较高的提取率。 其次，以丹酚酸B的回收率和分配系数为指标，考察了不同乙醇／硫酸铵双水相体系的萃取效果。结果表明，分配系数和回收率均随硫酸铵和乙醇质量分数的增大而增大，随pH增大先增大后减小。在pH2.0的粗提液中，当硫酸铵和乙醇的质量分数分别为25％和20％时，分配系数为95.58，回收率为97.93％，证明双水相萃取丹酚酸B是可行的。 再次，用吸附动力学和热力学方法研究了聚酰胺树脂对丹酚酸B的吸附特性，对影响吸附的因素，如丹酚酸B的初始浓度、平衡时间、吸附溶液的pH、温度等进行了考察。实验结果表明，聚酰胺树脂对丹酚酸B的吸附等温线符合Langmuir吸附等温线，在初始浓度分别为0.16、0.43、2.66mg／mL时，聚酰胺树脂对丹酚酸B的吸附量分别为69、196、376mg／g。丹酚酸B在聚酰胺树脂上的吸附过程符合二级吸附动力学特征。pH显著影响丹酚酸B的吸附量，当pH＜3时，为高吸附量区，3＜pH<5时，为过渡区，吸附量随着溶液pH增大而锐减，当pH＞5时，为低吸附量区。这种吸附行为表明氢键和静电吸附是产生吸附的主要作用。吸附热力学研究表明，聚酰胺树脂对丹酚酸B的吸附是一个放热过程，ΔH=-50.0kJ／mol；是一个熵减少过程，ΔS=-147.3J／mol；是一个自发过程，在25，30，35，45℃时，Gibbs自由能（ΔG）分别为-6.17，-5.40，-4.64和-3.22kJ／mol，Gibbs自由能随温度升高而减小，表明升高温度不利于吸附的进行。 最后，研究了聚酰胺树脂为介质纯化丹酚酸B的柱层析工艺，对影响层析效果的主要因素，如聚酰胺树脂粒度、药液的pH、药液浓度和流速等进行了优化。实验结果表明，如果以大颗粒聚酰胺树脂（60-100目）为介质，最佳流速是1mL／min，药液浓度是2.4mg／mL，pH为2.0，以3倍柱体积（3BV）水除杂、以1BV 20％和5BV 70％乙醇洗脱，收集70％洗脱液，浓缩除醇，冷冻干燥，得含量为53.53％的丹酚酸B，收率为83.00％，对药材收率为2.29％左右。如果以小颗粒聚酰胺树脂（100-200目）为介质，流速为3.5mL／min，以3BV水除杂，以1BV 20％、1.5 BV 50％和1.5-4BV 70％乙醇洗脱，收集含丹酚酸B的70％洗脱液，浓缩除醇，冷冻干燥，得含量大于95％的丹酚酸B，收率为30％。 总之，本研究结果表明，丹酚酸B的酯水解和苯并呋喃开环是丹酚酸B降解的主要途径，温度和pH是影响丹酚酸B稳定的主要因素；微波干燥丹参鲜药材与冷浸提取相结合，可加快丹酚酸B的溶出速率，双水相萃取与聚酰胺树脂层析相结合可实现对丹酚酸B的纯化。本研究为丹酚酸B的药用开发提供了科学依据。