蛹虫草形成子实体表型差异的分子生物学研究

蛹虫草(Cordyceps militaris（L．）Link)在我国又叫北冬虫夏草，是一种能寄生多种鳞翅目昆虫蛹及幼虫的真菌。其在功能食品、医药和生物学技术等方面都具有很好的价值。近年来国内外生产上市的一些名为冬虫夏草(Cordyceps sinensis（Berk．）Sace)的药品和功能食品，实际上大部分都是采用蛹虫草生产的。人工培养蛹虫草是解决野生虫草来源不足的良好途径，但是在人工培养蛹虫草过程中，菌种退化现象严重是制约产业化开发的一大瓶颈。到目前为止，国内外针对蛹虫草异核体与配型方面进行系统的分子生物学研究鲜见报道，然而从这两个方面的研究入手却能在遗传物质差异水平上很好的揭示蛹虫草退化本质。 本研究中，实验第一部分，对本实验室保存的一优势蛹虫草原始菌株（编号：WWM04）进行单孢子分离，共获得22个单孢子分离株，采用米饭培养基培养确证，其中20个完全不产子实体，2个能产子实体；对6个完全不产子实体单孢子分离株、1个经12次转接后退化的菌株和原始菌株的菌落形态特征和菌丝体生长速率等方面进行比较观察，结果表明：不产子实体的单孢子分离株的菌落形态特征和菌丝生长速率等方面特征不仅与原始菌株和转接退化菌株都存在很大差异，并且它们彼此之间的差异也非常大。以上结果说明蛹虫草具有多型现象。 第二部分，对4个菌落形态典型的不产子实体单孢子分离株、1个产子实体单孢子分离株、1个经12次转接后退化的菌株和原始菌株，采用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术和核糖体RNA基因（rDNA）转录间隔区（ITS）序列分析；然后采用NTSYS-pc软件对RAPDs图谱构建UPGMA聚类图，采用PAUP*4.0bata10软件基于ITS序列构建分子系统发育树状图。结果表明：所有实验菌株彼此之间RAPDs图谱差异都很大，不产子实体单孢子分离株的RAPDs图谱不仅与原始菌株和转接退化菌株都存在很大的差异，并且在它们彼此之间的差异更大，原始优势对照菌株与转接退化菌株之间的RAPDs图谱差异却相对较小；所有实验菌株，彼此之间的ITS序列差异却很小。以上结果初步显示蛹虫草菌种退化现象严重的主要原因可能是由准性生殖导致遗传物质严重改变造成的。 第三部分，设计MAT1-1-1、MAT1-2-1两个高保守交配型基因的引物，摸索最适PCR反应条件，对16个不产子实体单孢子分离株、2个产子实体单孢子分离株、1个经12次转接后退化的菌株和原始菌株进行交配型和交配型基因方面的研究。结果表明所有不产子实体单孢子分离株具备的是单一配型，不是MAT1-1型就是MAT1-2型，而所有能产子实体的菌株都具备MAT1-1和MAT1-2两个配型，该结果说明蛹虫草是异宗配合真菌；基于MAT1-2-1交配型基因序列进行的分子鉴定与ITS序列的结果一致，说明采用MAT1-2-1基因和ITS序列都能对菌株进行分子鉴定。