孑遗植物银杏的分子亲缘地理学研究

孑遗植物银杏（Ginkgo biloba L.）是世界著名的“活化石”植物,目前在世界许多地方都广泛栽培。我国可能存在银杏第四纪冰期残存群体,关于银杏的冰期避难所以及群体遗传结构一直以来都是科学家们感兴趣的课题。本研究通过单亲遗传的cpDNA限制性片段长度多态性（Polymerase Chain Reaction-RestrictionFragment Length Polymorphism,PCR-RFLP）,cpDNA trnK基因和trnS-trnG基因间隔区序列变异,双亲遗传的nrDNA的扩增长度多态性（Amplified FragmentLength Polymorphism,AFLP）,以及mtDNA的had2内含子序列信息,对银杏在中国的13个群体,以及日本、欧洲和北美的样品,进行了分子亲缘地理学研究。在以往研究的基础上,本研究对中国银杏的群体遗传结构和遗传多样性水平进行了探讨,同时,结合群落生态学资料、地质历史事件、化石资料以及末次冰期植被重建的资料,推测了第四纪冰期银杏在中国的避难所,并对避难所群体及栽培群体的遗传结构和遗传多样性进行了分析,提出了保护策略。主要研究结果如下: 1.cpDNA的PCR-RFLP分析 cpDNA的PCR-RFLP分析中,中国的12个银杏群体以及日本、欧洲、北美的样品共220个个体的基因间隔区序列trnK1-trnK2经限制性内切酶HinfI和MspI酶切后,共产生19种单倍型类型。西南地区群体重庆金佛山（JF）、贵州务川（WC）、盘县（PX）和杉坪（SP）以及湖北恩施（ES）的单倍型多态性（h）为0.7714～0.8875,东部地区的浙江西天目山（TM）单倍型多态性（h）为0.8485,中国西南地区的群体和东部浙江西天目山地区形成了两个单倍型中心。分子变异（AMOVA）的分析结果表明,银杏群体内遗传变异（94.17%）大于群体间遗传变异（5.88%）,GST=0.2。在本研究室以前的研究基础上,同时结合群落学资料,确定了中国西南地区是银杏第四纪冰期在中国的避难所之一。 2.cpDNAtrnK基因和trnS-trnG基因间隔区序列分析 在中国的13个银杏群体以及日本、欧洲、北美地区的样品共145个个体中,cpDNA trnK基因和trnS-trnG基因间隔区序列呈现出9个单倍型类型和11个变异位点（信息位点5个）。银杏物种水平的核苷酸多态性（p）为0.62×10-3,单倍型多态性（h）为0.289,总体遗传多样性水平较低。西南地区的JF、WC、SP、PX和ES群体一共有5种单倍型,其中4种为特有单倍型,单倍型多态性（h）为0.00～0.56,核苷酸多态性（p）为0～1.72×10-3。东部TM群体有3种单倍型,其中2种为特有单倍型,单倍型多态性（h）为0.47,核苷酸多态性（p）为0.53×10-3。AMOVA分析结果显示遗传变异主要存在群体内（61.94%）,但群体间已经出现相当程度的遗传分化（38.16%）,Fst=0.38065,Gst=0.25038。cpDNA单倍型分布、单倍型系统发育分析以及网状支系分析（Nested Clade Analysis）表明,中国西南地区为银杏第四纪冰期在中国的避难所,另外,还首次确定了东部浙江西天目山地区为银杏的另一个避难所。冰期后,银杏群体并没有经历过明显的群体扩张,但在西南地区避难所群体外围存在一定程度的短距离扩散。银杏的自然扩张能力有限,而人类的引种和白果买卖促进了银杏在各群体中的传播。 3.AFLP分析 AFLP分析了中国13个银杏群体以及欧洲样品共106个个体,6对引物组合共产生109条带峰值清晰、可重复、可判读的条带,其中62条（56.88%）为多态性条带。西南地区的ES群体（0.103）,中部地区的DH群体（0.100）,以及东部的TM群体（0.102）具有较高的遗传多样性水平。栽培群体TC、TX以及欧洲栽培银杏遗传多样性水平很低,分别为0.027、0.043和0.068。中部栽培群体由于种质来源丰富和群体的混杂从而具有较高的遗传多样性。AMOVA分析结果表明银杏群体的遗传变异主要存在于群体内（73.57%）,但群体间已经发生了显著的遗传分化（26.43%）,Fst=0.29。Neighbor-Joining分析、PCoA分析以及Structure和BAPS的分析表明,西南地区群体和中部-东部地区群体呈现出两个独立进化的路线,同时,西南地区群体和东部地区群体分别具有4条特有的条带,因此,我们进一步确定了中国的西南地区和东部浙江西天目山地区为银杏第四纪冰期在中国的避难所。欧洲的群体与中国的群体之间、栽培群体SX、TX和TC均出现了显著的遗传分化。与历史记载一致,欧洲银杏并非直接起源于中国,但与中国东部群体具有较近的亲缘关系。由于AFLP分析中缺乏日本的银杏材料,所以无法获得欧洲银杏通过日本传播的分子证据。 4.mtDNA nad2内含子序列分析 克隆测序得到的nad2内含子序列分析表明银杏不同个体之间存在高度变异,我们推测造成这种高度变异的原因可能是PCR过程的错配在克隆测序后的反映,同时发现该序列的二级结构中有较大的颈环结构,可能会阻碍PCR过程顺利进行。由于这些随机分布的变异位点不能作为分析的信息位点,因此,nad2内含子序列不适合用于银杏的分子亲缘地理学研究。 5.银杏的进化历史及保护策略 本研究揭示的银杏群体遗传结构表明,在中国存在两个避难所——中国西南的贵州、重庆和湖北交界地区以及东部的浙江西天目山地区。CpDNA单倍型被保留在两个避难所地区,冰期后,银杏群体并没有经历明显的群体扩张。银杏群体的遗传变异主要存在于群体内,但群体间、地区间已经发生了相当程度的遗传分化。栽培群体与避难所群体也发生了显著的遗传分化,遗传多样性程度低于避难所群体,欧洲和北美的银杏遗传多样性程度都较低。为了保护避难所地区的遗传多样性,我们提出了相应的保护策略:（1）对避难所群体实施就地保护策略,对银杏古树进行挂牌,纳入国家保护范围;（2）在迁地保护、取样以及育种时,尽可能在多个群体中取样,最大限度地保护银杏的遗传多样性。 本研究的创新点和特色:（1）较系统的群体取样,分析了包括中国、日本、欧洲和北美的银杏样品;（2）结合了两种分子标记——单亲遗传的叶绿体基因组和双亲遗传的核基因组信息;（3）确定了银杏在中国的两个冰期避难所,并推测了银杏的亲缘地理历史;（4）初步探讨了中国栽培银杏群体和欧洲银杏的遗传多样性程度及可能的起源。