自噬在胆汁淤积诱导肝损伤中的作用及其机制研究

胆汁淤积是胆汁生成或流动障碍所致的组疾病的共同临床症状，它是胆管系统的结石、炎症、肿瘤等众多肝胆系统疾病的重要临床表现之。此外近年来由于腹腔镜技术的普及，医源性胆道损伤导致的胆汁淤积也有上升的趋势。胆汁淤积造成肝损伤的过程中，胆盐毒性作用直是大家关注的焦点。甘氨鹅脱氧胆酸(GCDC)是胆汁成分中的重要胆盐之，具有较强的损伤作用，持续高浓度的毒性胆盐在血液和肝中持续滞留被认为是导致肝损伤的主要原因。毒性胆盐刺激可使肝细胞损伤、胆管增殖、肝纤维化；如果未能及时纠正，可逐渐进展为胆汁淤积性肝硬化，最终导致肝功能衰竭。尽管近年来其分子机制研究取得了些进展，但胆汁淤积引起肝细胞损伤的具体机制仍未完全阐明，对许多无法手术的患者，仍缺乏有效的治疗手段。因此，从分子水平进步深入探讨胆汁淤积引起肝细胞损伤的机制，可能为药物治疗提供新的思路。 自噬是细胞通过降解其自身的细胞质（器）来为生物合成提供可循环利用的原料，借此维持细胞内环境稳定和蛋白代谢平衡的过程。当细胞处于不利环境时，它是种重要的自我保护机制，对维持细胞存活、避免凋亡有积极的作用。目前自噬在胆汁淤积诱导肝损伤过程中的作用仍不清楚。本课题拟从三个方面对此进行研究:1、通过体内动物胆管结扎模型和体外细胞实验两个方面观察胆汁淤积对肝细胞的损害作用；2、探讨自噬在胆汁淤积性肝损伤中的作用；3、进步研究具体的分子机制，探讨ROS在胆汁淤积诱导肝损伤过程中的作用及其与自噬的关系。第一部分胆汁淤积性肝损伤模型的建立 首先在体外建立甘氨鹅脱氧胆酸（GCDC）诱导的肝细胞损伤模型。应用不同剂量的GCDC处理正常肝细胞系L02不同时间，观察不同剂量的GCDC对L02肝细胞存活的影响以及药物和剂量、时间之间的依赖关系。结果证实：甘氨鹅脱氧胆酸（GCDC）能够在体外诱导肝细胞死亡，щ随其浓度增加，肝细胞生长抑制率亦明显上升；其次通过对小鼠进行胆管结扎（BDL），模拟体内病生理过程，建立小鼠胆汁淤积模型。通过检测小鼠体内血清胆红素、ALT、AST等各项指标，观察胆汁淤积模型是否构建成功。结果提示，双重结扎小鼠胆管后血清胆红素及ALT、AST等各项指标随着时间的延长均有显著升高，提示胆汁淤积模型建立成功。 第二部分自噬在胆汁淤积诱导肝损伤中的作用 以GCDC（200μM）处理L02细胞，通过荧光显微镜观察转染了GFP-LC3质粒的细胞中GFP-LC3点的聚集，并以透射电镜观察自噬小体的聚集情况；通过WesternBlotting在蛋白水平检测LC3的表达，从多方面检测GCDC是否影响肝细胞自噬的发生。同时为了进步明确自噬是否影响胆汁淤积造成的肝细胞损伤，使用自噬抑制剂氯喹（CQ）或自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin）作用于肝细胞，应用流式细胞仪检测自噬被抑制或促进前后细胞凋亡的变化，从而探讨自噬在胆汁淤积诱导肝损伤中的作用。体内实验方面，使用CQ或Rapamycin作用于BDL模型小鼠，TUNEL检测抑制或诱导自噬后小鼠肝细胞凋亡的变化；对肝组织进行病理分析，比较各实验组肝细胞坏死程度。结果显示：GCDC处理L02细胞后可在荧光显微镜н观察到大量点状绿色荧光分布，说明GCDC可以诱导自噬的发生，电镜检测和Western Blotting进步证实了该结果；随后通过流式细胞术检测发现，CQ抑制自噬后肝细胞凋亡增加，Rapamycin促进自噬后细胞凋亡减少，而坏死无明显变化，提示自噬可能通过抑制GCDC诱导的肝细胞凋亡保护肝细胞。另外在BDL小鼠中，CQ抑制自噬后TUNEL显示肝细胞凋亡明显增加，HE显示肝组织的损伤明显加重；Rapamycin组结果则相反，也提示在体内自噬可能是通过抑制细胞凋亡，从而促进BDL模型中肝细胞的生存。 第三部分自噬通过清除ROS保护胆汁淤积诱导的肝损伤 为探讨ROS在胆汁淤积诱导肝损伤中的作用及其与自噬的关系，实验分为三个步骤。首先检测GCDC作用н ROS的活性，发现GCDC能够诱导ROS的产生，而抗氧化剂NAC能够抑制ROS的累积。随后为了探讨ROS和自噬之间的关系，使用Western Blotting检测GCDC诱导自噬过程中，NAC作用前后LC3的变化。结果显示，NAC能使GCDC诱导的LC3表达部分н调，说明ROS含量的变化与自噬的发生相关。 动物体内实验中选用细胞DNA氧化损伤的标志8-OHdG作为间接检测ROS含量的指标，结果显示BDL组中8-OhdG含量低于CQ+BDL组，而Rapamycin组结果相反，也说明抑制自噬后ROS含量增多，提示ROS可能参与了BDL诱导的自噬。最后，我们研究了自噬对GCDC诱导肝损伤的保护过程中ROS的作用。结果提示CQ抑制自噬后ROS的含量增多，MTT检测证实NAC作用后CQ组细胞生存率明显上升，提示GCDC诱导的自噬可能通过降低ROS的含量从而保护细胞存活。 综上，我们的研究结果提示： 1.胆汁淤积能够诱导肝细胞发生自噬，自噬能够促进受损肝细胞的存活，减少肝细胞的凋亡；自噬被抑制后其对肝细胞的保护作用明显降低。 2. ROS参与了GCDC诱导的肝细胞损伤，自噬可能通过降低ROS的含量来减少GCDC诱导的肝细胞损伤。