哮喘患者支气管肺泡灌洗液中肥大细胞功能特性的研究

前言 支气管哮喘(哮喘)是一种常见病、多发病，对人类危害极大。该病影响着大约10％的世界人口，在不同的国家或地区其发病率不同。哮喘的发病可能是多个基因与环境因素相互作用的结果。其比较成熟的关于发病机制的理论仍为Ⅰ型变态反应学说，而IgE依赖性肥大细胞激活是该理论的核心，也正是本文的研究内容。 与非哮喘者相比，哮喘患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中肥大细胞的数量增多、肥大细胞分泌的组胺和类胰蛋白酶的水平增高。这些现象与气流阻塞程度呈现的正相关，提示肥大细胞激活是哮喘发病机制中关键的一步。这一点也被光镜和电镜下所见到的哮喘患者局部抗原激发后BALF中的肥大细胞脱颗粒现象所证实。 然而，人们对于哮喘患者BALF中肥大细胞的功能特征却了解较少。由于直接观察哮喘患者BALF中的肥大细胞对理解哮喘时气道中肥大细胞的作用有极大的意义，故本实验对哮喘患者BALF中肥大细胞的功能特征进行了研究。 实验材料和方法 一、实验材料：茶碱、腺苷(9-β-D-Ribofuranosyladenine)、腺苷衍生物(NECA：5′-N-ethylcarboxamidoadenosine)、离子载体钙A23187(CI)、Ⅰ型胶原酶、Ⅰ型透明质酸酶、青霉素和链霉素、牛血清白蛋白、含25mM HEPES的MEM、绵羊抗鼠免疫球蛋白、extr-抗生物素蛋白过氧化物酶和o-苯二胺(OPD)均由Sigma公司购得，山羊抗人IgE抗体、组胺酶联免疫试剂盒购于Serotec公司(Kidlington，Oxford，UK)。 二、实验方法 1．同意行支气管肺泡灌洗液检查的29名稳定期轻度支气管哮喘患者参与了本研究。 2．BALF肥大细胞激发试验：将经Olympus BF光学纤维支气管镜回收的BALF用消毒过的尼龙滤器过滤，并用含2％小牛血清的缓冲液冲洗两 次。在取出10gi进行细胞计数后，剩下的细胞再重新悬浮于含钙、镁离子 缓冲液中。激发过程在 LP。试管中完成，即在预先加完 50 gi抗 IgE抗体、 CI、腺着、腺昔衍生物州ECAX缓冲液或抗 IgE抗体十腺耷、抗 IgE抗体十 茶碱、腺着十茶碱的试管中分别加人100gi细胞悬液，并在37叱水浴箱中 培养20分钟。激发反应由向置于冰上的试管中立即加人100gi冷缓冲液， 并立即离心而终止。上清液与细胞分离后于一20℃冻存。 3．BALF肥大细胞组胺测定：采用组胺酶联免疫反应试剂盒来检测。 其检测方法以100gi的标准品、对照品或标本与50gi的酸化溶液混匀后， 在室温下反应豆小时。取 50 pl化后的标准品、对照品或标本加人到已包 被过抗体的96孔盘内，再于每孔内加入200gi酶标物并在4吃条件下培养 18 ／J’时。洗俄加 200gi底物显色，然后用酶标仪Li 410inn光波长读盘。 4．组织中肥大细胞的分离和激活：手术切除的经病理证实大体正常的 肺或大肠组织切成小块放人含互型胶原酶和1型透明质酸酶的消化液中在 37叮摇动水浴箱中分别培养60分钟和70分钟。悬浮的细胞通过滤过器 p径二皿pM）与未消化的组织碎片分离，然后放人含10％小牛血清的培养 液中于室温下培养伤小时。悬浮的细胞经不含钙、镁离子的缓冲液冲洗两 次后，再重新悬浮于缓冲液中。激发过程在LP试管中完成，即在预先加完 50则抗 IgE抗体人I或缓冲液的试管中加人 100gi细胞悬液，并在37吃水 浴箱中培养 20分钟。激发反应由向置于冰上的试管中立即加人 150gi冷 缓冲液，并立即离心而终止。上清液与细胞分离后于一20六冻存。 5．组织中肥大细胞的组胺测定：用以玻璃纤维为基础的荧光方法测定 细胞悬液中的组胺水平。 6．类胰蛋白酶水平测定：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）的方法以抗 类胰蛋白酶血清为二抗进行铺盘，并置于 4℃条件下过夜。用 3％BSA阻断 非特异性蛋白质结合位点后，加人类胰蛋白酶标准品或待测样品，每孔 50 pl。以抗类胰蛋白酶单克隆抗体为识别 1抗使之与标准品或待测样品中 的类胰蛋白酶结合，并以生物素结合的羊抗鼠免疫球蛋白为＊抗与extr一 抗生物素蛋白过氧化物酶结合。最后用。一苯二胺显色并用酶标仪以 490urn光波长读盘。 7．统计学方法：全部统计分析均采用SPSS门础i＊10．0）软件。数据 以二士或M来表示。P＜0刀5为统计学上有显著差异。 ·2· 结 果 乙在哮喘患者 BALF中，加人抗 IgE抗体浓度低至 0．of％时即可诱导 哮喘患者 BALF中肥大细胞释放 ZI．1％的组胺，而非哮喘着肺和大肠中· 1％的抗IgE抗体浓度仅诱导18．5％和16．9％的组胺。将抗除抗体浓度 从0．of％增加到3％对哮喘患者BALF’中肥大细胞的组胺释放量无明显影 ＊。 本实验抗IgE抗体对哮喘和非哮喘患者肥大细胞分泌组胺影响的敏感 性截然不同，与之相对应本实验哮喘患者BALF中的肥大细胞对CI刺激的 反应与非哮喘者肺和肠的反应相似，例如 lopol／L浓度的 CI可分别引起 40．0％乃6．8％及39·8％的组胺释放。腺耷浓度达100opOUL时仍无明显 刺激组胺释放的作用，仅在浓度高达1000pmoUL时方可诱导哮喘患者 BALF中肥大细胞释放约17％的组胺。NE