金免疫层析技术在克百威残留快速测定中的应用研究

本研究选择了氨基甲酸酯类杀虫剂-克百威为研究对象,利用免疫层析技术研制了用于检测克百威残留的竞争性金免疫层析试纸及测定方法:即利用克百威和试纸条膜上的克百威-卵清蛋白(OVA)包被抗原竞争性结合金标记抗克百威多克隆抗体的方法,通过胶体金的显色原理达到快速、简便地检测样品中的克百威残留。 采用柠檬酸三钠还原氯金酸法,用微波炉加热,制备了不同粒径的胶体金,以17.5nm左右的胶体金标记抗克百威多克隆抗体的显色效果较好。胶体金标记抗克百威多克隆抗体时,pH值宜控制在7.5～8.0之间较适合,抗体的加入量为12μg/ml。选用ARIST公司的吸水垫、样品垫、玻璃纤维纸(结合垫)和Millipore公司的HF24004硝酸纤维素膜作为试纸条材料,用三维喷点平台分别将0.97mg/ml的克百威-OVA结合物和0.48 mg/ml羊抗兔IgG间隔5mm平行定量喷涂固化于硝酸纤维素膜上作为测试线和质控线,将金标记抗克百威多克隆抗体以20μl/垫(条)定量滴加于玻璃纤维纸上,干燥硝酸纤维素膜和玻璃纤维纸。在PVC板上依次粘贴上已平行固化克百威-OVA结合物和羊抗兔IgG抗体的硝酸纤维素膜、已固定有金标记抗百威多克隆抗体的玻璃纤维纸、吸水垫和样品垫,用切刀将粘贴好的PVC板纵向切成3×60mm的试纸条。 将试纸条末端浸入待测样品中,停留20～30s后取出平放,10 min后观察结果。结果表明试纸条检测灵敏度为0.5μg/ml。该试纸条与5种克百威结构类似物在试验浓度范围内无交叉反应,特异性高,稳定性较好,有效期一年以上。应用试纸条分别对添加克百威标样的水样、青菜、梨和茶叶样品进行检测,对水样、青菜、梨样品的检测限为0.5μg/ml,且NC膜对青菜样品中的色素有很好的层析分离作用,但对茶叶样品尚不适用。制作成的试纸条结果显示清楚,能基本满足预防克百威急性中毒快速筛选检测的需要。本研究结果为应用金免疫层析技术、开发食品和环境中小分子化学污染物(如农药、兽药、抗生素、环境激素等)快速检测试纸提供了有重要价值的实验依据。