大鼠牙髓干细胞培养鉴定及生物学特性研究

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。目前已经成功分离培养包括来自骨髓、肌肉、神经、上皮等组织的成体干细胞。牙髓干细胞是位于牙髓组织的一种成体干细胞。2000年，Gronthos等首先成功地分离培养出人牙髓干细胞，为干细胞的研究开辟了一个新的领域。牙髓干细胞具有同其他成体干细胞相似的生物学特性，具有较强的克隆形成能力，可以分化为牙髓组织中的终末功能细胞并具有一定的横向分化能力。目前国内外只有人牙髓干细胞培养成功的报道，鼠牙髓干细胞的相关研究国内外还未见报道，而鼠是实验研究最常用的模型，它具有取材容易、与人同源性较高等优点，因此本研究以大鼠为实验对象，采用细胞克隆分离培养方式进行大鼠牙髓干细胞的培养，同时对大鼠牙髓干细胞进行了一系列生物学特性研究，为牙髓干细胞的研究增加了新的内容，为牙齿再生的研究奠定基础。 第一部分：大鼠牙髓干细胞的分离培养及鉴定 本部分实验采用细胞克隆分离培养的方式，对大鼠牙髓细胞进行克隆筛选，将获得的单细胞克隆来源的细胞进行体外诱导分化及体内接种实验，结果共获得4株单细胞克隆来源细胞株(282、6A11、8A1、8A7)，对282细胞株进行矿化液诱导，部分细胞出现细长的单个胞浆突起，与成牙本质细胞胞浆突起相似，同时出现牙本质特异性蛋白DSPP的表达。裸鼠体内种植实验结果表明，该株细胞经过8周的体内种植后，形成了类牙髓牙本质复合体结构，该结构具有前期牙本质、矿化牙本质、成牙本质细胞层及牙髓组织， 第四军医大学博士学位论文 与正常牙髓牙本质复合体结构相似，并表达牙本质特异性蛋白DSP。 第二部分:大鼠牙髓千细胞的生物学特征分析 首次培养成功的细胞株明确其生物学特征至关重要，本部分实验研究了 大鼠牙髓干细胞的形态学、生长及增殖、矿化能力、细胞克隆形成等一系列 细胞生物学特征，同时对大鼠牙髓干细胞的细胞周期与核型进行了检测，旨 在通过一系列细胞生物学研究方法对所获得的2B2株牙髓干细胞进行综合 分析及评测。结果显示大鼠牙髓干细胞2B2株为成纤维细胞样生长，细胞密 集区可见多角形或椭圆形细胞。从细胞生长曲线图来看，大鼠牙髓千细胞的 生长能力弱于大鼠骨髓间充质干细胞，其生长曲线在8一10天达到最大值，该 细胞株群体倍增时间为58.3小时。大鼠牙髓干细胞的克隆形成率为2.55%， 较第一部分大鼠牙髓细胞的克隆形成率为高。细胞核型及致瘤性检测表明该 细胞株无染色体畸形及致瘤性等肿瘤细胞特性。大鼠牙髓千细胞经过一定的 诱导后，出现了矿化结节，表明具有一定的矿化能力。以上对牙髓干细胞的 生物学特性研究为其进一步的功能学研究奠定了基础。 第三部分:大鼠牙髓千细胞的功能学特征分析 本部分实验从三个方面对大鼠牙髓干细胞2B2株进行研究。实验一采用 免疫组织化学的方法进行了大鼠牙髓干细胞相关蛋白的检测。研究结果表 明，未经诱导的大鼠牙髓干细胞DMPI仅个别细胞阳性表达，DSP少量细胞 阳性表达，而CBFAI、BMPZ为阳性染色。经矿化液7一10天的诱导后，大 鼠牙髓干细胞DSP染色出现部分细胞强阳性，DMPI出现阳性表达，表明矿 化液的诱导使部分大鼠牙髓干细胞具有了成牙本质细胞的特征。实验二对大 鼠牙髓干细胞的脂肪、神经、肌肉转分化进行研究。在对大鼠牙髓干细胞进 行适当的诱导后，采用RT一PCR的方法对诱导前后相关特异性蛋白mRNA 的表达进行检测，结果表明:大鼠牙髓干细胞可以向脂肪细胞系进行转分化， 表明具有一定的横向分化能力，而向神经及肌肉细胞系方向的分化没有阳性 结果，表明常规诱导条件下，大鼠牙髓干细胞不具备向神经细胞系、肌细胞 系横向分化的能力。实验三采用TGF一p做为细胞诱导因子，对大鼠牙髓干 细胞进行一定的诱导，研究其生物学特性的改变。结果表明经过TGF一p诱 导后，大鼠牙髓干细胞内总蛋白含量增加，细胞生长及增殖能力明显增强， 碱性磷酸酶活性增强表明该细胞具有了更强的矿化能力，诱导后出现DSPP 第四军医大学博士学位论文 的阳性表达表明TGF一p可以促使该细胞株向成牙本质细胞方向分化。 综上所述，本研究以大鼠作为研究对象，采用细胞克隆分离培养模式首 次成功获得了大鼠牙髓千细胞2B2株，并对其进行了鉴定。在此基础上对该 细胞株的细胞生物学特性进行了一系列的研究，为牙髓干细胞研究领域提供 了新的研究工具，为牙齿再生及牙齿发育研究奠定了基础，具有重要的理论 意义和潜在的临床应用前景.