鸭白细胞介素2配体与受体alpha的研究

基于鸡白细胞介素2（chIL-2）全基因序列设计引物探针，以简易基因组抽提法获得的鸭外周血单核细胞基因组DNA为模板，用长距离聚合酶链式反应（LD-PCR）扩增鸭白细胞介素2（duIL-2）全基因片段，得到的duIL-2基因组DNA序列全长为3528bp。运用生物信息学方法对duIL-2的基因结构、启动子结构和预测的成熟蛋白进行系统分析，在此基础上对推测的duIL-2蛋白的三维结构分子模型进行了构建。结果表明：duIL-2基因具有典型的4外显子3内含子结构，与已知的鸡和哺乳类同系物基因总体结构具有明显的相似性；鸭和鸡及其它哺乳动物IL-2基因的启动子序列具有显著的保守性，都具有AP-1，NF-AT，CD28RE，OCT，TATA box转录起始因子结合位点和预测的转录起始位点；推测的duIL-2基因的阅读框长420bp，编码一条由140个氨基酸组成的多肽；duIL-2基因推测的成熟蛋白进化分析表明，鸭和鹅的亲缘关系最近，和哺乳动物的亲缘关系比较远，显示出明显的种属差异；三维结构预测表明，duIL-2蛋白具有典型的四alpha螺旋捆绑结构。 以RT-PCR方法克隆的鸭白介素2的cDNA为模板，PCR扩增鸭IL-2成熟蛋白的编码序列。将此序列插入pBAD／HisB和pET28a原核表达载体多克隆位点，构建pBAD／HisB-duIL-2和pET28a-duIL-2重组子，分别转化大肠杆菌LMG194和BL21（DE3）宿主菌，经阿拉糖和IPTG诱导，实现了鸭白介素2蛋白（rduIL-2）体外重组表达。SDS-PAGE分析显示，表达蛋白的分子量约分别为18.7KDa和14.6KDa。Western Blot分析表明，表达的重组蛋白能分别被anti-Xpress和anti-His单克隆抗体识别。以pET28a系统表达的rduIL-2蛋白为原材料，尝试了两种复性策略制备复性rduIL-2蛋白结构单体：一种是借助梯度稀释对变性纯化的rduIL-2单体进行复性；一种是借助FPLC对非变性纯化的rduIL-2单体进行简易氧化复性。前者的复性产物中含有rduIL-2多聚体和单体两种形式，且产率很低。后者可以获得高产量的复性单体。PF-2D分析表明复性单体等电点为3.4，反相二维色谱没有分离到潜在的异构体。非变性条件制备的rduIL-2复性单体4℃存放一周没有形成沉淀，而变性复性策略获得复性产物则形成可见絮状沉淀。 以纯化的rduIL-2免疫BALB／c小鼠，将其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，杂交瘤细胞筛选，有限稀释法克隆，成功获得5株能分泌抗鸭IL-2蛋白的单克隆抗体（mAb）细胞系：1H4、283、4G12、5F6和5H6。除mAb 5H6为IgG2a亚类外，其余4株mAb类型均为lgG1亚类，5株mAb的轻链都为κ链。Western-blot分析表明，所获得的5株抗鸭IL-2单克隆抗体与鸭IL-2具有反应性，其中5H6对鸡IL-2具有交叉反应性。细胞免疫化学分析表明，单克隆抗体283、4G12、1A4以及多抗均能够识别真核细胞瞬时表达系统表达的鸭重组IL-2。体外阻断实验证明，mAb 2B3能够明显抑制duIL-2对鸭脾细胞的增殖效应。 以rduIL-2复性单体为活性标准品，进行了鸭白介素2体内外生物学活性研究：用MTT法测定了rduIL-2的体外淋巴细胞增殖活性；以鸡为模型，静脉注射rduIL-2，观察其体内生物学效应；研究了rduIL-2蛋白对重组禽流感灭活疫苗免疫效力的影响。结果表明：rduIL-2复性单体能刺激T淋巴细胞增殖，且呈剂量依赖性；高剂量连续注射rduIL-2引起鸭发热、多脏器炎症等毒副作用；鸡静脉注射低rduIL-2（0.1-25μg）后，其CD4+T细胞上调，且上调水平与注射剂量没有直接相关性，而CD8+T细胞含量变化不明显。低剂量的鸭IL-2能够明显提高重组禽流感灭活疫苗HI效价，而剂量过高则会抑制重组禽流感灭活疫苗免疫效力。 根据鸡白介素2受体alpha链（ChlL-2Rα）cDNA序列设计多对引物探针，结合RACE技术克隆了duIL-2受体alpha cDNA（命名为DuCD25或者duIL-2Rα）。克隆的cDNA序列长886bp，其cDNA编码一条由226个氨基酸组成的前体蛋白，该前体蛋白含有由20aa残基构成的信号肽序列；预测的duIL-2Rα成熟蛋白与鸡IL-2Rα同源性61％，与哺乳类同系物同源性在15-25％之间。对10个物种IL-2Rα氨基酸序列分析发现，禽类和哺乳类有23个aa对应位点完全保守。duIL-2Rα的8个半胱氨酸残基中，有7个对应位点与鸡和哺乳类完全保守；我们也发现，哺乳类IL-2Rα的P24-P25、N90-A91、P111-K112、1185-R186位点之间和胞内羧基末端，在进化过程中分别出现了1、3、1、26-29和9-16个氨基酸插入现象，然而在进化过程中，哺乳类IL-2Rα并没有发生任何aa残基缺失的现象。二级结构分析表明，duIL-2Rα成熟蛋白羧基末端含有25个氨基酸残基（182-206）构成的跨膜区。 将duIL-2Rα胞外链PCR产物亚克隆入原核表达载体pET32a，构建重组表达载体pET32a-duIL2Rα，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导实现了duIL2Rα蛋白在大肠杆菌的表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达蛋白的分子量约为40KDa，可以被anti-His单克隆抗体识别。可溶性分析表明，经pET32a系统表达的duIL-2Rα主要以包涵体的形式存在。表达的重组蛋白经Ni2+层析柱变性纯化产率极低，采用制备包涵体的方法，每升培养液中可获得32mg rduIL2Rα蛋白粗制品。 用纯化的rduIL-2Rα包涵体蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠，经细胞融合，杂交瘤细胞筛选，有限稀释法克隆，最终获得15株持续、稳定分泌抗rduIL-2Rα原核表达产物的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为1A4，3B6，7C8，1C5，3D1，1E4，2E1，6E1，6E9，2F4，6F2，4G10，3H11，4H3，6H7（抗体类型均为IgG1，κ）。对15株单抗Western blot鉴定结果表明，与rduIL-2Rα均具有反应性。细胞免疫化学分析表明，仅有5株（1A4，3H11，4G10，3D1，6F2）能够特异识别经Vero细胞瞬时表达的duIL-2Rα蛋白。进一步利用Con A诱导的内源性duIL-2Rα作为抗原，筛选到两株能够识别duIL-2Rα天然表位的抗体（3H11，6F2）。 利用H9N2亚型禽流感病毒感染模型，以rduIL-2 Rα单克隆抗体6F2为检测抗体，借助流式细胞术，研究了鸭DuCD25+细胞在病毒感染免疫应答中的表达动态。结果表明，健康鸭脾细胞仅有少量DuCD25+细胞（＜4％），而感染鸭脾细胞中的DuCD25+细胞比率以固定斜率直线式迅速上调，到48h达到峰值，随后逐渐下降，至感染后144h降至正常水平，说明DuCD25+细胞在机体抗病毒感染的免疫应答过程中扮演着重要角色。