基于RANKL/RANK/OPG轴的绝经后骨质疏松症发病机制及健骨颗粒干预研究

一、目的： 阐明去卵巢大鼠骨质疏松症与RANKL/RANK/OPG系统的关系,以及健骨颗粒干预对该系统及破骨细胞RANK信号通路关键节点的调节作用,从破骨细胞的分化和功能调节的角度揭示健骨颗粒防治绝经后骨质疏松症的作用机制。 二、方法： 1去卵巢骨质疏松大鼠OPG/RANKL表达的动态变化及健骨颗粒的干预作用。 1.1动物实验：6月龄雌性SD大鼠160只,随机分成假手术组、去卵巢模型组、去卵巢+雌激素组和去卵巢+健骨颗粒组各40只。各组行双侧卵巢结扎切除术,假手术组除未行卵巢结扎切除外,其余步骤同模型组。术后3天健骨颗粒组给予健骨颗粒2g·kg-1·d-,雌二醇组给予17β--雌二醇100μg·kg-1·d-1,假手术组和模型组以生理盐水灌胃。术后2、6、12、24周每组分别处死10只,取血清、股骨、胫骨和腰椎骨备用。 1.2指标检测：双能X射线检测骨密度；三点弯曲法行股骨生物力学检测；胫骨上段制作石蜡切片,MASSON染色和TRAP染色后进行形态学分析骨小梁面积和破骨细胞量;ELISA检测血清中的TRAP、BALP、OC、RANKL和OPG含量；腰椎骨分别提取组织RNA和蛋白,实时荧光定量PCR法检测RANKL/OPG的mMRNA表达,Western Blot法检测RANKL/OPG蛋白的表达。 2健骨颗粒对破骨细胞分化和RANK信号通路的影响 2.1含药血清制备：取3月龄雄性SD大鼠20只,分为中药组和对照组各10只,中药组给予健骨颗粒2g·kg-1·d-1,对照组给予生理盐水2m1·d-,连续灌胃7天,于最后一次灌胃后1h腹主动脉无菌取血,凝固后离心取血清备用。 2.2细胞培养和指标检测：破骨细胞前体细胞株RAW264.7分为阴性对照组、空白血清组和含药血清组。阴性对照组不加RANKL,空白血清组和含药血清组在50ng/ml RANKL诱导下,分别加入10%空白血清和健骨颗粒含药血清培养。干预6天后行TRAP染色,观察计算破骨细胞分化情况；干预24、48、96小时后分别提取细胞RNA蛋白,实时荧光定量PCR法和Western Blot法检测RANK信号通路受体、TRAF6、NF-κB(P50和P52亚基)、c-Fos和NFATcl的mRNA及蛋白的表达。 三、结果： 1去卵巢术后12周模型组与假手术对照组相比,骨密度和骨生物力学指标持续下降,造模成功。去卵巢术后2-12周模型组破骨细胞增加,血清TRAP和血清BALP, OC等骨重建指标均明显升高,补充雌激素可逆转去卵巢导致的骨密度和骨生物力学指标下降,以及骨重建指标变化。与假手术组相比,模型组术后2周骨RANKL表达升高而血清RANKL下降,术后6-24周与假手术组相比均无显著差别。术后2周模型组骨组织OPG明显下降,随后逐渐升高,但与同期假手术对照组相比,模型组骨OPG始终较低；血清OPG在术后6-12周明显低于假手术组。补充雌激素可缓解去卵巢后骨组织和血清RANKL/OPG的变化。相关性分析表明骨RANKL与破骨细胞骨吸收呈正相关,但与血清RANKL无相关性；骨OPG与骨重建指标负相关,与血清OPG表达水平呈正相关。 2健骨颗粒干预可明显增加去卵巢大鼠的骨密度,提高骨生物力学性能,降低去卵巢大鼠骨组织破骨细胞量和血清TRAP、BALP和0C等骨重建指标表达。健骨颗粒可降低去卵巢大鼠骨组织RANKL的表达,提高去卵巢大鼠骨组织和血清OPG的表达。 3RANKL刺激增加破骨前体细胞RANK受体及其信号通路下游转录因子NF-κB (P50)、c-Fos和NFATcl的mRNA和蛋白表达,从而诱导破骨细胞分化。健骨颗粒含药血清能抑制RANKL诱导的体外破骨细胞分化,降低RANK通路受体、c-Fos、NFATcl的mRNA和蛋白表达,但对NF-KB和TRAF6的表达无明显作用。 四、结论： 1RANKL和OPG表达水平均随大鼠去卵巢术后时间呈动态非线性变化。血清OPG水平可作为绝经后骨质疏松症预测和防治疗效观察的参考指标。 2健骨颗粒能缓解去卵巢后骨组织RANKL和OPG表达的异常变化,降低骨重建水平,达到防治绝经后骨质疏松症的目的。 3健骨颗粒可通过下调RANK受体及其信号通路下游转录因子c-Fos和NFATcl的表达,抑制破骨细胞的分化,降低骨吸收水平,从而防治骨质疏松症。