益糖康通过激活AMPK/SIRT-1信号通路对糖尿病心肌病的保护机制研究

目的:本研究旨在探讨益糖康对糖尿病心肌病大鼠糖脂代谢紊乱,心功能,氧化应激水平,糖尿病心肌病大鼠心肌细胞和高糖诱导的H9c2细胞的AMPK/SIRT-1信号通路的影响,以及对下游蛋白表达的影响,揭示益糖康对糖尿病心肌病的保护机制及作用靶点。材料与方法:1.选取SPF级Wistar雄性大鼠64只,按体重随机分为对照组8只,给予普通饲料,其余56只给予高脂饲料,喂养4周。然后按照50mg/kg体重剂量,空腹注射链脲佐菌素(STZ),72小时后空腹血糖高于16.7mmol/l的大鼠42只,认定为糖尿病大鼠。按血糖值随机分为模型组、中药组、西药组,中药组给予益糖康煎剂(剂量21g/kg)灌胃6周,西药组给予二甲双胍溶液(200mg/ml浓度)灌胃,剂量为10ml/kg,对照组和模型组均给予等体积的蒸馏水灌胃,每日1次,连续灌胃6周。分别在造模前及造模后第2、4、6周末,通过采集大鼠尾尖血液的方式,用血糖仪检测各组大鼠的空腹血糖情况,记录并分析。于第6周末,通过超声心动图检测各组大鼠心脏结构及功能情况。给予大鼠异氟烷吸入麻醉,连接Ⅱ导联心电图,应用超声检测仪进行HR、LVIDd、LVIDs、LVPWd,LVPWs、E/A、EF、FS的检测。模型组经检测出现LVIDd、LVIDs显著增加,LVPWs显著降低,说明模型组大鼠左室内径增加、左室后壁厚度变薄;并出现E/A比值显著降低(E/A<1),说明模型组大鼠心功能出现异常,结合所测血糖水平,判断为糖尿病心肌病大鼠造模成功。检测结束后,大鼠予以10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉,腹主动脉取血,存放于抗凝管中。解剖大鼠,取大鼠心肌组织,放入多聚甲醛溶液中进行固定。并检测大鼠血清TC、TG、INS、MDA、SOD,通过HE染色观察大鼠心肌形态;用Western Blot法检测大鼠心肌AMPK、p-AMPK、SIRT-1、PGC-1α、PPARγ、FOXO3a等蛋白表达水平。2.SPF级Wistar雄性大鼠30只,按体重随机分为对照组15只,益糖康组15只,分别给予蒸馏水和21g/kg益糖康灌胃,每日1次,持续7天。在灌胃第7天,给药2小时后取血,制备含药血清。3.培养H9c2细胞,传代后,分为空白组、高糖组和益糖康组。高糖组和益糖康组用33.3mmol/l的葡萄糖诱导48小时。空白组和高糖组加入空白组大鼠血清,益糖康组加入益糖康含药血清,各组再孵育48小时。各组血清的体积分数均为15%。随后检测各组中的细胞活性及ROS水平,Western Blot法检测细胞中AMPK、SIRT-1、PGC-1α、PPARγ、FOXO3a蛋白表达水平。再次培养细胞,传代后,分为空白组、益糖康组和AMPK抑制剂组。益糖康组和AMPK抑制剂组用33.3mmol/l的葡萄糖诱导48小时。空白组加入空白组大鼠血清;AMPK抑制剂组加入AMPK抑制剂Dorsomorphin和益糖康含药血清;益糖康组加入益糖康含药血清,各组再孵育48小时,用Western Blot法检测细胞中AMPK、SIRT-1、PGC-1α、PPARγ、FOXO3a蛋白表达水平较益糖康组是否有明显差异;再次培养细胞,传代后,分为空白组、益糖康组和SIRT-1抑制剂组。益糖康组和SIRT-1抑制剂组用33.3mmol/l的葡萄糖诱导48小时。空白组加入空白组大鼠血清;SIRT-1抑制剂组加入SIRT-1抑制剂Selisistat和益糖康含药血清;益糖康组入益糖康含药血清,各组再孵育48小时,用Western Blot法检测细胞中AMPK、SIRT-1、PGC-1α、PPARγ、FOXO3a蛋白表达水平。结果:1.干预6周后,评价大鼠症状积分,与对照组比较,模型组、中药组、西药组大鼠症状积分均显著升高(P<0.01);与模型组比较,中药组、西药组症状积分显著降低(P<0.01);与西药组比较,中药组大鼠症状积分显著降低(P<0.01)。2.干预前,与对照组比较,各组大鼠空腹血糖均显著升高(P<0.01);模型组、中药组、西药组之间没有显著差异(P>0.05)。分别在干预2、4、6周后,测大鼠血糖,结果显示,中药组与西药组显著低于模型组(P<0.01),中药组与西药组没有明显差异(P>0.05)。3.干预前,与对照组比较,各组大鼠体重均显著升高(P<0.01);模型组、中药组、西药组之间没有显著差异(P>0.05)。分别在干预2、4、6周后,测量大鼠体重,结果显示,与对照组比较,各组大鼠体重均显著降低(P<0.01);与模型组比较,中药组与西药组大鼠体重显著升高(P<0.01),中药组与西药组之间没有明显差异(P>0.05)。4.与对照组相比较,模型组、中药组、西药组大鼠TC、TG均显著增高(P<0.01),INS显著降低(P<0.01);与模型组相比较,中药组、西药组大鼠TC、TG均显著降低(P<0.01),INS显著升高(P<0.01);中药组与西药组之间没有明显差异(P>0.05)。5.与对照组相比较,模型组、中药组、西药组大鼠MDA均显著增高(P<0.01),SOD显著降低(P<0.01);与模型组比较,中药组与西药组大鼠MDA均显著降低(P<0.01),SOD显著升高(P<0.01);中药组与西药组之间没有明显差异(P>0.05)。6.大鼠心脏超声检查结果表明,与对照组相比,模型组、中药组及西药组大鼠HR减慢(P<0.01)、LVIDd、LVIDs显著增加(P<0.01)、LVPWs显著降低(P<0.01);E/A比值、短轴缩短率(FS)和射血分数(EF%)均显著降低(P<0.01)。给药6周之后,中药组和西药组明显提高糖尿病心肌病大鼠的HR(P<0.01),降低LVIDd、LVIDs(P<0.01),提高LVPWs(P<0.01),并明显提高糖尿病心肌病大鼠E/A、FS和EF(P<0.01)。7.各组大鼠蛋白表达情况:结果表明,与对照组相比,各组大鼠心肌组织的AMPK、p-AMPK、p-AMPK/AMPK、SIRT-1、PGC-1α、PPARγ以及细胞浆中FOXO3a水平明显降低(P<0.01),细胞核中FOXO3a蛋白表达水平均显著升高(P<0.01);与模型组对比,中药组与西药组明显增加了AMPK、p-AMPK、p-AMPK/AMPK、SIRT-1、PGC-1α、PPARγ以及细胞浆中FOXO3a的表达情况(P<0.01),降低细胞核中FOXO3a蛋白水平(P<0.01);中药组和西药组之间比较没有显著差异(P>0.05)。8.在高糖诱导的H9c2细胞中检测了ROS,与对照组细胞比较,H9c2细胞与35m M葡萄糖共孵育导致ROS产生显著增加(P<0.01),细胞活性显著降低(P<0.01);而经过益糖康治疗后,显著降低了高糖诱导的心肌细胞ROS产生(P<0.01),并提高细胞活性(P<0.01)。9.与空白组比较,各组上清液中AMPK、SIRT-1、PGC-1α、PPARγ和细胞浆FOXO3a含量均显著降低(P<0.01);与高糖组比较,益糖康组上清液中AMPK、SIRT-1、PGC-1α、PPARγ和细胞浆FOXO3a含量均显著升高(P<0.01);AMPK抑制剂组中,AMPK、SIRT-1、PGC-1α、细胞浆FOXO3a含量较益糖康组显著降低(P<0.01)。SIRT-1抑制剂组中,AMPK、SIRT-1、PGC-1α、PPARγ含量较益糖康组显著降低(P<0.01)。结论:1.益糖康可以改善糖尿病心肌病大鼠的糖脂代谢紊乱及心功能异常。2.益糖康可能通过降低氧化应激反应,对糖尿病心肌病大鼠心肌细胞损伤具有保护作用。3.益糖康可能通过促进糖尿病心肌病大鼠心肌细胞AMPK、SIRT-1、PGC-1α蛋白的表达,进而提高PPARγ蛋白的表达、抑制细胞核FOXO3a蛋白的表达,降低氧化应激反应,保护糖尿病心肌病。4.益糖康含药血清可以降低高糖诱导H9c2细胞的氧化应激,提高细胞活性。5.益糖康在高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤中的保护作用可能首先是通过激活AMPK而实现的。6.益糖康含药血清可能部分通过激活AMPK/SIRT-1信号通路,促进PGC-1α、PPARγ蛋白的表达,抑制细胞核FOXO3a蛋白的表达,降低氧化应激,保护高糖诱导的H9c2细胞。