疏密波诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究

目的探讨疏密波促进软骨细胞生成的最佳波段组合,并从分子生物学水平阐述疏密波调控BMSCs向软骨细胞表型分化的机制,为疏密波治疗仪应用于临床提供实验依据。 方法（1）实验于2006-10/2008-03在福建中医学院中西医结合研究院完成。清洁级健康4周龄SD大鼠24只,雌雄不限,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,动物处理方法符合动物伦理学标准。（2）抽取SD大鼠骨髓液,采用全骨髓贴壁培养法经体外分离、纯化、培养获得SD大鼠BMSCs,取传至第3代SD大鼠BMSCs（F3 BMSCs）进行后续研究。（3）疏密波发射仪由福州大学生物医学仪器研究所提供。根据同一周期内疏波、密波分配比例的不同,分为以下3种工作模式:模式Ⅰ:疏波:密波=1:1;模式Ⅱ:疏波:密波=2:1;模式Ⅲ:疏波:密波=1:2。（4）取F3 BMSCs分别按5×10～5/ml接种于50ml细胞培养瓶,以1×10～5/ml的密度接种于预置盖玻片的六孔板中,接种24h后加入含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM培养液,根据仪器工作模式的不同分为:疏密波1:1组、疏密波2:1组、疏密波1:2组及空白对照组;各诱导组按干预时间的不同又分为2个亚组:诱导30分钟组和诱导60分钟组,每天诱导1次。诱导3天后进行MTT检测,研究疏密波对BMSCs增殖的影响。诱导14天后,采用RT-PCR、甲苯胺蓝染色及免疫组化染色等方法,研究疏密波对BMSCs向软骨细胞表型分化过程的影响。 结果（1）各疏密波诱导组均可促进BMSCs增殖。统计分析表明:各诱导组与空白对照组相比均有非常显著性差异（P＜0.01）;组内相比无显著性差异（P＞0.05）。实验结果表明:疏密波的促增殖作用与波形的组合有关,且以疏密波1:2组为最佳。（2）诱导14d后,各疏密波诱导组Cbfa1mRNA,Sox9mRNA均呈阳性表达,而空白对照组未表达。统计分析结果表明:与空白对照组相比较,各组的Cbfa1mRNA、Sox9mRNA表达均有显著性差异（P＜0.01）,其中疏密波1:2组优于疏密波2:1组,疏密波2:1组优于疏密波1:1组;各疏密波诱导组组内的Cbfa1mRNA、Sox9mRNA表达均没有显著性差异（P＞0.05）。（3）甲苯胺蓝染色可见诱导后细胞胞质和细胞外基质异染,空白对照组无明显异染。（4）免疫组化染色可见各诱导组多数细胞的胞浆呈棕黄色阳性表达,且疏密波1:2组Ⅱ型胶原的表达优于疏密波2:1组,疏密波2:1组优于疏密波1:1组,空白对照组细胞为阴性表达。 结论（1）不同组合的疏密波均可促进BMSCs增殖,尤以疏密波1:2组为最佳。（2）疏密波可促进BMSCs向软骨细胞表型分化,可优化骨组织工程的种子细胞体系,改善软骨组织的质量,延缓软骨的退变过程。