背景
肿瘤已逐渐成为人类重大杀手之一,其死亡率仅次于心脑血管疾病,而且呈上升的态势。目前化学药物抗肿瘤作用确切,疗效显著,但毒副作用大,长期应用易产生耐药性等,所以人们迫切希望找到疗效好且毒副作用小的药物,中药在这方面显示出了明显的优势。
斑蝥(Mylabris)中药名。芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥虫体,性味辛、热,有大毒,归肝、胃、肾经,功效破血消症,攻毒蚀疮,发泡冷久。用于症瘕癌肿,积年顽癣,瘰疬,赘疣,痈疽不溃,恶疮死肌。现代药理学研究认为,斑蝥抗癌的主要成分为斑蝥素,对原发性肝癌、乳腺癌、消化道肿瘤等有一定疗效,但由于对胃肠道等的毒性作用限制了其在临床上的应用。去甲斑蝥素(norcantharidin, NCTD)是根据斑蝥素的化学结果,去1、2位甲基合成的,不仅具有明显的抗癌作用,且毒副作用较小,同时具有升白、保护肝细胞、调节免疫功能等作用。临床上主要用于治疗乳腺癌、食管癌及胃癌等、鉴于肿瘤的高发病率及NCTD在肿瘤治疗中的重要作用,本研究探讨了NCTD对肝癌H22细胞及结肠腺癌Caco2细胞的生长抑制作用和诱导凋亡的作用,并对NCTD抗肝癌H22细胞的免疫学机理进行了初步探讨。
目的
1熟悉并建立稳定的实验肿瘤学研究方法
2观察去甲斑蝥素对肿瘤增殖的影响
3观察去甲斑蝥素对免疫功能和骨髓有核细胞增殖的影响
方法
1肝癌H22细胞的体外增殖抑制实验
利用MTT法检测NCTD对肝癌H22细胞的生长抑制率。设3×105个/ml、2×105个/m1、1×105个/m1、8×104个/ml四个浓度细胞悬液,接种96孔板,绘制H22细胞的生长曲线,确定最佳给药时间及细胞浓度。配制7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L、480μmol/L七个浓度梯度的NCTD溶液,作用H22细胞不同时间点后,利用MTT检测技术统计NCTD的生长抑制率,光学显微镜下观察细胞形态。
2 H22荷瘤小鼠模型制作及NCTD的抗瘤作用研究
2.1 H22荷瘤小鼠模型制作：
37℃复苏H22细胞,将细胞密度调为5×109/L,以0.2ml/只无菌注入NIH小鼠腹腔进行接种传代,于接种7d左右,小鼠腹部膨隆,可用于小鼠皮下移植瘤的接种。于无菌条件下抽取H22腹水瘤小鼠的腹水,以1640液稀释后,离心(1000r/min,5min)洗涤细胞2次,调整H22细胞密度为1×109/L,除正常对照组之外,其余5组于右前肢腋下皮下注射H22细胞悬液0.2mL。
2.2动物分组和给药方法：
NIH小鼠72只,适应性饲养4d后,随机分成正常对照组、模型组、环磷酰胺组、去甲斑蝥素低、中、高剂量组,剂量分别为1、2、Smg·kg-1·d-1,共6组,每组12只(雌雄各半)。接种24h后环磷酰胺组及去甲斑蝥素低、中、高剂量组腹腔注射环磷酰胺50mg/kg化疗第一次,第8天化疗第二次；正常组、模型组、环磷酰胺组按0.2ml/10g分别开始灌胃给生理盐水,连续给药14d；去甲斑蝥素低、中、高剂量组腹腔注射去甲斑蝥素,连续给药14d；通过游标卡尺判定H22肿瘤的生长情况。
2.3瘤体和免疫器官测量
于实验第15d处死小鼠,剥离瘤体、脾、胸腺,分别称质量,计算抑瘤率：P抑瘤(%)=(m模型组-m实验组)/m模型组×100%。、脾脏指数=胸腺质量(mg)/体重(g)、胸腺指数=胸腺质量(mg)/体重(g)。
3免疫功能相关指标的测定
3.1淋巴细胞转化实验测定小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数。
3.2以流式细胞检测方法测定小鼠脾脏T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+的比重变化,小鼠骨髓有核细胞凋亡率及细胞周期的变化,以及小鼠NK细胞杀伤活性的改变。
3.3使用ELISA法对对实验各组小鼠血清的IL-2、TNF-α的含量经行测定。
4 NCTD对结肠癌Caco2细胞体外的增殖抑制及凋亡实验
设1.2×105个/ml、1×105个/ml、8×104个/m1、5×104个/ml四个浓度细胞悬液,接种96孔板,绘制Caco2细胞的生长曲线,确定最佳给药时间及细胞浓度。配制7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L、480μmol/L七个浓度梯度的NCTD溶液,作用Caco2细胞不同时间点后,利用MTT检测技术统计NCTD的生长抑制率,光学显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞检测技术测定Caco2细胞的生长抑制率及凋亡率。
结果
1 NCTD对肝癌H22细胞的体外的增殖抑制的影响
采用7个不同浓度(7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L、480μmol/L)的NCTD不同时间点作用H22肿瘤细胞,发现NCTD在一定的时间和浓度范围内,对H22细胞的抑制作用是随着NCTD的浓度增加和作用时间的延长而增加的,具有明显的时间-效应和剂量-效应关系,IC50为60μmol/L的NCTD作用H22细胞36h。去甲斑蝥素孵育前,倒置显微镜下观察各组细胞生长状态良好,细胞形态与数目无明显差异,添加相应浓度去甲斑蝥素6个时间点镜下观察细胞不同浓度下,随着时间延长,计量的增加,镜下凋亡小体出现并逐渐增多,膜破坏,成碎片状细胞逐渐更多。
2 NCTD对荷瘤小鼠模型的抗瘤作用研究
去甲斑蝥素对H22有明显的抑制作用,且抑瘤率与给药剂量呈一定正相关关系。去甲斑蝥素高剂量与CTX合用组抑瘤作用最强,瘤重最小,抑瘤率为65.11%,与CTX相比,差异有统计学意义(P<0.05)。从胸腺指数的结果来看,低剂量的去甲斑蝥素3.19±1.24与单纯的环磷酰胺2.38±0.61比较具有统计学意义。
3.NCTD对荷瘤小鼠免疫功能的影响
3.1对免疫器官的影响：脾脏指数结果来看中剂量去甲斑蝥素9.78±4.24比单纯用环磷酰胺5.42±1.11的效果要明显(P<0.01)。说明去甲斑蝥素对H22有明显的抑制作用,且有提高胸腺、脾脏指数的效应。
3.2对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,与CTX组1.97±1.63比较,中、高剂量NCTD组5.35±0.83、7.94±3.87有显著性差异(P<0.05,P<0.01),低剂量组3.18±1.07差异不显著；与模型组2.73±0.97比较,高剂量NCTD组7.94±3.87有显著性差异(P<0.01)。说明去甲斑蝥素可有效提高免疫抑制后小鼠的淋巴细胞功能。
3.3对脾脏T细胞亚群的影响
通过流式细胞检测仪,结果显示CTX组及NCTD高剂量合用CTX组与正常组、模型组比较,对脾脏细胞免疫有抑制作用(P<0.01或P<0.05)；与CTX组比较,NCTD低剂量合用CTX组CD3+为11.4%),CD4+占7.3%(P<0.05),CD8+是2.88%(P<0.05),有统计学意义,与正常组、模型组比较无差别;与正常组比较,中剂量NCTD对脾脏CD3+T细胞有影响(P<0.05),其他影响不明显。
3.4对小鼠NK细胞活性的影响
NCTD高剂量组29.17±1.4%则与正常组32.7±2%无显著性差异,说明高剂量的NCTD可以显著提高H22荷瘤小鼠NK细胞活性,通过CTX组与NCTD高剂量组的比较也可以看出,有统计学意义(P<0.01),与模型组比较也只有NCTD高剂量组有统计学意义(P<0.01)。
3.5对小鼠血清IL-2及TNF-α的影响
使用ELISA法检测结果,NCTD中、高剂量组37.08±0.23pg·ml-1、47.83±1.75pg·ml-1与正常组23.6±2.28pg·ml-1比较差异显著(P<0.01),说明NCTD能有效刺激H22荷瘤小鼠分泌IL-2,使血清IL-2的含量升高；与CTX组15.71±3.06pg·ml-1比较NCTD三个剂量组28.09±0.45pg.ml-1,37.08±0.23pg·ml-1,47.83±1.75pg.ml-1均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。
NCTD能有效刺激H22荷瘤小鼠分泌TNF-α,使血清TNF-α的含量升高与CTX组11.87±2.73pg.ml-1比较,CTX联合NCTD中、高剂量组TNF-α19.97±0.94pg·ml-1, 45.1±0.52pg.ml-1均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。
4对小鼠骨髓有核细胞的影响
实验结果显示,与CTX比较,NCTD低剂量与CTX合用对骨髓有核细胞凋亡率没影响,而NCTD中剂量与高剂量与CTX合用能提高骨髓有核细胞凋亡率(P<0.01)；CTX组显示其将骨髓有核细胞阻止于G2/M期,CTX合用低剂量的NCTD对该期骨髓有核细胞没影响,合用中、高剂量的NCTD明显减少该周期的细胞比率(P<0.05,P<0.01),处于G1/G。期的细胞比率无明显差异。
5 NCTD对结肠癌Caco2细胞的体外的增殖抑制及凋亡的影响
7个不同浓度(7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L、480μmol/L)的NCTD不同时间点作用Caco2肿瘤细胞,发现NCTD在一定的时间和浓度范围内,对Caco2细胞的抑制作用是随着NCTD的浓度增加和作用时间的延长而增加的,具有明显的时间-效应和剂量-效应关系。去甲斑蝥素孵育前,倒置显微镜下观察各组细胞生长状态良好,细胞形态与数目无明显差异,添加相应浓度去甲斑蝥素6个时间点镜下观察细胞不同浓度下,随着时间延长,计量的增加,镜下凋亡小体出现并逐渐增多,膜破坏,成碎片状细胞逐渐更多。流式检测得到NCTD作用Caco2细胞分别24h、48h,发现随着剂量的增加,凋亡细胞的百分率逐渐升高,在一定时间一定浓度范围内,60μmol/L的NCTD作用Caco2细胞48h时,凋亡率是最高的,当NCTD浓度继续升高后,其凋亡率呈下降趋势。
结论
1去甲斑蝥素对H22肿瘤细胞有抑制作用,随着NCTD的浓度增加和作用时间的延长,抑制作用越明显,具有明显的时间-效应和剂量-效应关系；
2去甲斑蝥素对H22肿瘤细胞有明显的抑制作用,且抑瘤率与给药剂量呈一定正相关关系。其作用机理可能与提高机体免疫力,增强机体细胞免疫功能有关。
3去甲斑蝥素对Caco2肿瘤细胞具有明显的抑制作用,NCTD在一定的时间和浓度范围内,对Caco2肿瘤细胞的抑制作用是随着NCTD的浓度增加和作用时间的延长而增强的,具有明显的时间-效应和剂量-效应关系。
