排铅聚糖对铅染毒小鼠的治疗作用机理及其毒理学研究

【目的】铅是构成地壳的元素之一，在地球上分布广泛，普遍存在于空气、土壤、和水体中。由于铅及其化合物在工业和生活中的应用较为广泛，人们接触铅的机会也大大增加。研究表明，铅可通过被污染的饮水、空气、食物和吸烟等进入人体，一部分可在人体内蓄积并产生慢性毒性。铅毒性作用的主要危害是干扰造血系统血红素的合成，使血红蛋白降低，出现贫血；可使中枢神经系统与周围神经系统受损，引起中毒性脑病和周围神经病；对消化系统、泌尿系统、心血管系统、生殖系统、免疫系统、内分泌系统都可产生危害，干扰钙磷的代谢。目前对于铅中毒疾病的治疗方法很多。其中排铅保健食品是一种对人体毒副作用小，排铅效果显著的重要方法。本实验把排铅聚糖作为一种新型排铅保健食品进行小鼠动物实验，主要从排铅聚糖对铅染毒小鼠的治疗保护作用及其毒理学方面进行研究，为寻求一种安全有效的预防治疗铅中毒的方法提供理论依据。 【方法】 1．排铅聚糖的最大耐受剂量(MTD)实验 取20g左右的健康昆明种小鼠14只，雌雄各半，按小鼠最大灌胃容量0.4ml／10g剂量，给予排铅聚糖最大混悬浓度60mg／ml灌胃1次，观察1周，记录体重变化及死亡情况。 2．排铅聚糖的遗传毒理学实验 取18～22g健康昆明种小鼠30只，雌雄各半，按体重随机分为5个剂量组：环磷酰胺阳性对照组，生理盐水阴性对照组，排铅聚糖高、中、低剂量组。于第4次染毒后24h进行外周血和骨髓微核实验，并取脑、肝、肾观察其大体解剖学改变并称重。 3．排铅聚糖的生殖毒理学试验 取30～35g健康昆明种雄性小鼠30只，按体重随机分为5组：环磷酰胺阳性对照组，生理盐水阴性对照组，排铅聚糖高、中、低剂量组。于第1次染毒后35d进行精子畸变实验，在光镜下观察精子形态改变，计算精子畸变率。并取脑、肝、肾观察其大体解剖学改变并称重。 4．排铅聚糖对铅中毒小鼠的排铅实验 取18～22g健康昆明种小鼠50只，雌雄各半，按体重随机分成5组：生理盐水阴性对照组，排铅聚糖低、中、高剂量组，醋酸铅模型对照组。醋酸铅模型对照组及低、中、高剂量组用醋酸铅注射造成铅中毒模型后，各剂量组灌胃给予排铅聚糖，阴性对照组和模型对照组给予生理盐水。实验结束后取血并处死小鼠，取肝、肾、股骨、脑，经消化后用原子吸收分光光度计测定铅的含量。 5．排铅聚糖对铅中毒小鼠血液、肝、脑、肾、骨中其他必需金属元素的影响 取18～22g健康昆明种小鼠50只，雌雄各半，分组及处理同4．排铅聚糖对铅中毒小鼠的排铅实验。实验结束后取血并处死小鼠，取肝、肾、股骨、脑，经消化后用原子吸收分光光度计测定钙、镁、铁、锌、铜、锰的含量。 6．排铅聚糖对铅遗传毒性的拮抗作用 6．1各组小鼠的外周血和骨髓微核实验 取18～22g健康昆明种小鼠120只，雌雄各半，根据体重随机分为6组：环磷酰胺阳性对照组，生理盐水阴性对照组，醋酸铅对照组，排铅聚糖低、中、高剂量组，分别于第2次及第4次染毒后48h处死进行外周血和骨髓微核实验。 6．2排铅聚糖对急性铅染毒小鼠肝、脑、肾中排铅作用 取18～22g健康昆明种近交小鼠60只，雌雄各半，分组与处理同6．1各组小鼠的外周血和骨髓微核实验。第4次染毒后48h处死小鼠，取其脑、肝、肾，消化后测其中铅的含量，以观察排铅聚糖对急性铅染毒的排出情况。 6．3排铅聚糖对急性铅染毒小鼠肝、脑、肾中钙、镁、铁、锌、铜等必需金属元素的影响 取18～22g健康昆明种近交小鼠60只，雌雄各半，分组与处理同6．1各组小鼠的外周血和骨髓微核实验。第4次染毒后48h处死小鼠，取其脑、肝、肾，消化后测其中钙、镁、铁、锌、铜等元素的含量，以观察排铅聚糖对急性铅染毒小鼠的必需金属元素的影响。 7．排铅聚糖对染铅小鼠生殖损伤的恢复作用 取30～35g健康昆明种近交雄性小鼠49只，根据体重随机分为7组：环磷酰胺阳性对照组，生理盐水阴性对照组，醋酸铅对照组，排铅聚糖高、中、低剂量组，排铅聚糖的中剂量预防组。于第1次染毒后35d处死进行精子畸变实验。在光镜下观察精子形态改变，计算精子畸变率。 8．排铅聚糖对铅抑制抗氧化酶系活性的恢复作用 取18～22g健康昆明种近交小鼠36只，雌雄各半。按体重随机分为6组：醋酸铅模型组，生理盐水阴性对照组，排铅聚糖低、中、高剂量组，排铅聚糖中剂量预防组。铅模型组及排铅聚糖各剂量组先进行铅染毒造成铅中毒模型，后排铅聚糖低、中、高剂量组给予不同剂量排铅聚糖，预防组则在染毒同时给予中剂量排铅聚糖。给药结束后分别取肝、脑、肾测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量。 同时取各组小鼠脑、肝、肾做病理切片，光镜下观察各脏器的病理改变情况。 9．排铅聚糖对铅所致肝、肾功能损伤的恢复作用 取18～22g健康昆明种近交小鼠36只，雌雄各半。分组及处理情况同8．排铅聚糖对铅抑制抗氧化酶系活性的恢复作用。给药结束后取血清测总蛋白及白蛋白含量、谷丙转氨酶(ALT)活力、谷草转氨酶(AST)活力、碱性磷酸酶(ALP)活力；测血尿素氮(BUN)、尿酸(UA)含量，观察排铅聚糖对铅中毒小鼠的肝功、肾功影响。 【结果】 1．排铅聚糖的最大耐受剂量(MTD) 排铅聚糖对健康昆明种近交小鼠的最大耐受剂量大于2.4g／kg，对小鼠体重不产生影响，无死亡现象。实验小鼠的脑、肝、肾重要脏器外观无明显大体病理损害。 2．排铅聚糖的遗传毒理学实验 小鼠的外周血和骨髓PCE微核率在排铅聚糖的高、中、低剂量组和阴性对照组之间两两比较均无统计学意义(P＞0.05)；而与环磷酰胺阳性对照组比较皆有统计学意义(P＜0.05)。各组小鼠脑、肝、肾重量两两比较皆无统计学意义(P＞0.05)。 3．排铅聚糖的生殖毒理学试验 结果表明：环磷酰胺阳性对照组精子畸变率高于阴性对照组，高、中、低剂量组(P＜0.05)；高、中、低剂量组和阴性对照组之间两两比较皆无统计学意义(P＞0.05)。小鼠体重变化在第37d各组差别有统计学意义(P＜0.05)，环磷酰胺阳性对照组下降较为明显，其余各组体重差别均无统计学意义(P＞0.05)。环磷酰胺阳性对照组除脑重与各组比较均无统计学意义(P＞0.05)外，肝重、肾重均低于其余各组(P＜0.05)；脑、肝、肾重在阴性对照组与三个剂量组之间比较均无统计学意义(P＞0.05)。 光镜下，环磷酰胺组精子形态及畸变率明显异常，其他各组均大致正常。 4．排铅聚糖对铅中毒小鼠的排铅实验 血液及各组织脏器中铅的含量，各剂量组均比阴性对照组高(P＜0.05)，均低于铅模型对照组(P＜0.05)，但没有明显的剂量-效应关系，且两两比较无统计学意义(P＞0.05)。各组小鼠体重变化两两比较均无统计学意义(P＞0.05)。 5．排铅聚糖对铅染毒小鼠血液、肝、肾、骨、脑中其他必需金属元素的影响 血钙各组比较均无统计学意义(P＞0.05)。肝钙、肾钙各组比较，阴性对照组高于低剂量组和铅模型对照组(P＜0.05)，但与中、高剂量组比较皆无统计学意义(P＞0.05)；铅模型对照组中肝钙、肾钙低于阴性对照组和中、高剂量组(P＜0.05)，但与低剂量组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；中、高剂量组高于低剂量组(P＜0.05)，但二者之间比较无统计学意义(P＞0.05)。骨钙阴性对照组高于其他各组(P＜0.05)，其余各组之间比较皆无统计学意义(P＞0.05)。脑钙各组比较，阴性对照组高于铅模型对照组(P＜0.05)，阴性对照组与三个剂量组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；铅模型对照组低于阴性对照组和三个剂量组(P＜0.05)，低、中剂量组低于高剂量组(P＜0.05)，低、中剂量组之间比较无统计学意义(P＞0.05)。 血镁含量高剂量组低于阴性对照组(P＜0.05)，其余各组两两比较均无统计学意义(P＞0.05)。铅模型对照组、高剂量组骨镁含量低于阴性对照组和低、中剂量组(P＜0.05)，高剂量组与铅模型对照组比较无统计学意义(P＞0.05)。肝镁、肾镁和脑镁各组两两比较均无统计学意义(P＞0.05)。 肝铁含量阴性对照组高于低剂量组和铅模型对照组(P＜0.05)，中、高剂量组高于铅模型对照组(P＜0.05)，而与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；三个剂量组之间相互比较差异无统计学意义(P＞0.05)。血铁、骨铁、肾铁、脑铁各组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。 血锌、肝锌、肾锌、脑锌在不同处理组之间比较无统计学意义(P＞0.05)；阴性对照组、低、中、高剂量组骨锌含量高于铅模型对照组(P＜0.05)，三个剂量组与阴性对照组之间两两比较均无统计学意义(P＞0.05)。 铜、锰在各组织中的含量各组之间比较差异皆无统计学意义(P＞0.05)。 6．排铅聚糖对铅遗传毒性的拮抗作用 6．1各组小鼠的外周血和骨髓微核实验结果 排铅聚糖第2次给药后小鼠外周血和骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核实验结果表明：环磷酰胺组与其余各组比较，均有统计学意义(P＜0.01)；醋酸铅对照组微核率高于高、中、低剂量组(P＜0.05)；高、中、低剂量组高于阴性对照组(P＜0.05)；高剂量组微核率低于中、低剂量组(P＜0.05)；中、低剂量组之间比较无统计学意义(P＞0.05)。 第4次给药后小鼠外周血和骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核实验结果表明：环磷酰胺组与其余各组比较，均有统计学意义(P＜0.05)；醋酸铅对照组微核率高于高、中、低剂量组(P＜0.05)；高、中、低剂量组高于阴性对照组(P＜0.05)；高、中剂量组微核率低于低剂量组(P＜0.05)；高、中剂量组之间比较无统计学意义(P＞0.05)。 6．2排铅聚糖对急性铅染毒小鼠肝、脑、肾中排铅作用 各组织中铅含量在铅对照组高于其他各组(P＜0.05)，阴性对照组低于其他各组(P＜0.05)，其他三个剂量组两两比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 6．3排铅聚糖对急性铅染毒小鼠肝、脑、肾中钙、镁、铁、锌、铜等必需金属元素的影响 排铅聚糖在急性铅染毒过程中驱铅的同时，钙、镁、铜含量各组比较无统计学意义，肝、肾中铁、锌含量比较排铅聚糖各剂量组均比醋酸铅对照组高(P＜0.05)。 7．排铅聚糖对染铅小鼠生殖损伤的恢复作用 各组小鼠的精子畸变率与阴性对照组相比均有统计学意义(P＜0.01)。排铅聚糖高、中、低剂量组和预防组小鼠的精子畸变率低于醋酸铅对照组(P＜0.01)。排铅聚糖高、中剂量组与预防组小鼠的精子畸变率低于低剂量组(P＜0.05)。排铅聚糖高、中剂量组及预防组小鼠的精子畸变率两两比较无统计学意义(P＞0.05)。 8．排铅聚糖对铅的抑制抗氧化酶系活性的恢复作用 排铅聚糖三个剂量组及预防组的GSH-Px的活力在肝、肾组织中比醋酸铅模型组均有升高(P＜0.05)，但低于阴性对照组(P＜0.05)，三个剂量组及预防组之间两两比较均无统计学意义(P＞0.05)；脑组织GSH-Px的活力在阴性对照组、三个剂量组及预防组均高于醋酸铅对照组(P＜0.05)，但在阴性对照组、三个剂量组及预防组之间两两比较均无统计学意义(P＞0.05)。 肝、肾、脑组织中SOD的活力在三个剂量组及预防组均高于醋酸铅模型组(P＜0.05)，低于阴性对照组(P＜0.05)；三个剂量组及预防组之间两两比较均无统计学意义(P＞0.05)。 肝、肾、脑组织中MDA的含量在三个剂量组及预防组均低于醋酸铅模型组(P＜0.05)，与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；三个剂量组及预防组之间两两比较均无统计学意义(P＞0.05)。 对组织切片在光镜下进行观察，醋酸铅模型组海马、肝脏和肾脏均有明显损伤，排铅聚糖各组的组织损伤均有一定程度的恢复。 9．排铅聚糖对铅所致肝、肾功能抑制的恢复作用 9．1对肝功的恢复作用 三个剂量组和预防组的总蛋白和白蛋白含量低于阴性对照组(P＜0.01)，高于模型对照组(P＜0.01)；三个剂量组和预防组之间总蛋白与白蛋白含量两两比较无统计学意义(P＞0.05)。 排铅聚糖高、中、低剂量组小鼠血清中ALT及AST均明显低于醋酸铅模型组(P＜0.05)，高于阴性对照组(P＜0.05)；血清中ALT、AST活力预防组低于醋酸铅模型组(P＜0.05)，与阴性对照组相比没有统计学意义(P＞0.05)；三个剂量组两两比较无统计学意义(P＞0.05)；血清中ALP活力各组与阴性对照组相比均没有统计学意义(P＞0.05)。 9．2对肾功的恢复作用 血尿酸及血尿素氮含量在排铅聚糖高、中、低剂量组及预防组均明显低于铅模型对照组(P＜0.05)，且高于阴性对照组(P＜0.05)；排铅聚糖三个剂量组及预防组之间相互比较均没有统计学意义(P＞0.05)。 【结论】 排铅聚糖的最大混悬浓度在最大灌胃容量情况下对小鼠无急性毒性作用。其高、中、低剂量对小鼠均无致突变性及生殖毒性；其能有效地排铅，对其他必需金属元素无促排作用；可以拮抗铅诱发的致突变性及生殖毒性；可以恢复抗氧化酶系活性，降低脂质过氧化反应，拮抗铅导致的肝功能、肾功能损害作用；显著改善铅对脑及肝、肾所造成的病理损害。综上所述，排铅聚糖属于一种安全有效的排铅保健食品；