茵陈蒿汤主要体内直接作用物质联合治疗酒精性肝损伤作用的机制研究

目的：揭示酒精性肝损伤小鼠尿液、血液、肝组织和原代肝细胞的代谢轮廓及代谢生物标记物,进而从代谢层面阐释茵陈蒿汤主要血中移行成分组方对酒精诱导肝损伤的治疗作用及机理,为中药创新药物研究奠定基础。方法：采用灌胃60%乙醇的方法复制酒精性肝损伤模型,首先进行生理生化指标及组织病理学评价：利用基于超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HDMS)的代谢组学技术对酒精性肝损伤小鼠尿液、血液、肝组织、细胞样品轨迹变化进行研究,采用模式识别的方法找到与酒精性肝损伤相关的生物标记物,进而用MetPA方法找到与之相关的代谢通路,对酒精性肝损伤的发生机制进行探讨,在此基础上研究茵陈蒿汤体内成分组方对酒精性肝损伤小鼠的治疗作用及机制。结果：1酒精性肝损伤模型的建立与评价采用60%乙醇溶液灌胃方法复制模型,对小鼠7天的生理生化指标和组织病理学进行分析,发现小鼠AST、ALT、MDA、TG、γ-GT含量明显升高,GSH含量明显降低,以上各项指标7天后有显著性差异(P<0.01)。HE染色发现模型组小鼠造模第7天时,视野可见中央静脉及肝窦显著扩张、淤血,肝细胞肿胀、拥挤,出现一定程度炎细胞浸润及灶性肝细胞坏死,细胞内出现空泡。TUNEL原位末端凋亡检测显示,模型组肝脏组织内凋亡细胞密布,染色较深,与空白组相比具有极显著差异(P<0.01)。CASPASE-3活性检测显示模型组浓染,CASPASE-3活性较强,分布范围广,面密度值高,活性表达面密度值与空白组相比有极显著差异(P<0.01)。表明本实验成功复制了小鼠酒精性肝损伤模型,为后续实验奠定基础。2酒精性肝损伤模型标记物的鉴定与分析(1)酒精性肝损伤小鼠尿液代谢轮廓及代谢标记物分析建立适用于小鼠尿液代谢组学研究的UPLC-HDMS分析方法,对酒精性肝损伤小鼠不同时间点的尿液进行代谢轮廓和模式识别分析。结果发现小鼠尿液代谢轮廓PCA分析显示不同时间点尿液样本明显分开,并且随着时间的推移,向着远离第0天尿液样本的方向变化,至第7天偏离程度最大。对造成代谢轨迹变化的潜在生物标记物进行表征,结合数据库检索鉴定出59个标记物。与正常组比较,模型组中的丙酮醛、甘氨酸、羟基乙酸、甜菜醛、1-吡咯啉-2-羧酸、L-脯氨酸、胍乙酸、L-缬氨酸、焦谷氨酸、哌啶酸、酰脲丙酸、苯乙酰胺、龙胆酸、L-苯丙氨酸、尿酸、L-酪氨酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙醇醛、N-(o)-羟精氨酸、苯乙酰甘氨酸、5-羟基犬尿氨酸、氨基葡萄糖-6-磷酸、酵母氨酸、泛硫乙胺、脱氧尿苷酸、5-胸苷酸、单磷酸脱氧腺苷、S-羟甲基谷胱甘肽、麦芽糖、单磷酸腺苷、S-腺苷蛋氨酸胺、二磷酸脱氧胞苷、二磷酸鸟酐、腺苷蛋氨酸硒、氧化谷胱甘肽表现为上调的趋势,乙醛酸、L-丙氨酸、组胺、尿嘧啶、苯乙醛、L-天冬氨酸、邻氨基苯甲酸、酪胺、2,5-二羟基苯甲醛、5,6-二羟基吲哚、乳清酸、甲酰氨基苯甲酸、磷酰胆碱、3,4-二羟基苯乙二醇、N-乙酰鸟氨酸、5-羟基吲哚乙醛、肾上腺素、葡萄糖醛酸、L-多巴、肌肽、脱氧尿苷、琥珀酰-L-二氨基庚二酸、苯乙胺葡萄糖醛酸、单磷酸脱氧尿甘、尿营酸表现为下降的趋势。这些标记物主要与苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸合成、苯丙氨酸代谢、嘧啶代谢、嘌呤代谢、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸合成、酪氨酸代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢、丙氨酸代谢、组氨酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯互变、丙氨酸,天冬氨酸盐和谷氨酸盐代谢、含硒氨基酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、泛酸盐和辅酶A合成相关。(2)酒精性肝损伤小鼠血液代谢轮廓及代谢标记物分析建立适用于小鼠血液代谢组学研究的UPLC-HDMS分析方法,对酒精性肝损伤小鼠的血液进行代谢轮廓和模式识别分析。结果发现空白组与模型组小鼠血液代谢轮廓PCA分析显示样本明显分开。对造成这种代谢轨迹变化的潜在生物标记物进行表征,结合数据库检索鉴定出29个标记物。与正常组比较,模型组中的D-麦芽糖、血栓素B2、甘氨酸酰胺、LysoPC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)) LysoPC(22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、L-尿胆素、粪卟啉I、三己糖基神经酰胺(d18:1/22:0).苯乙醛、哌啶酸、L-亮氨酸、3-羟基-2-氨基苯甲酸、硫酸去甲肾上腺素表现为上调趋势,肌酸、5,10-亚甲基-四氢叶酸、甘氨胆酸、LysoPC(20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))、氧化三甲胺、1-苯乙胺、4-胍基丁酸、磷酰胆碱、瓜氨酸、3-甲氧基酪氨酸、1-甲基鸟嘌呤核苷、牛磺胆酸、LysoPC(20:3(5Z,8Z,11Z))、PC(18:0/16:0) PI(18:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、3a,7a-二羟基-5b-胆甾-24-烯酰辅酶A表现为下降趋势。并找到了相关的9个代谢通路：甲烷代谢、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成、甘油磷脂代谢、苯丙氨酸代谢、原发性胆汁酸生物合成、淀粉与蔗糖代谢、色氨酸代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢。(3)酒精性肝损伤小鼠肝组织代谢轮廓及代谢标记物分析建立适用于小鼠肝组织代谢组学研究的UPLC-HDMS分析方法,对酒精性肝损伤小鼠的肝组织样品进行代谢轮廓和模式识别分析。结果发现空白组与模型组小鼠肝组织代谢轮廓PCA分析显示样本明显分开。对造成这种代谢轨迹变化的潜在生物标记物进行表征,结合数据库检索鉴定出30个标记物。与正常组比较,模型组中的花葵素、15-氧代前列腺素E2、11-羟孕酮-11-葡萄糖醛酸、LysoPC(O-18:0)、牛黄胆酸、3-丁烯基-1(3H)-异苯并呋喃酮、脱氧胞苷酸、5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸、7-甲基鸟苷-5-磷酸、γ-生育三烯酚表现为上调趋势,腺嘌呤、鸟嘌呤、半胱氨酰甘氨酸、丁酰肉碱、S-乙酰基二氢硫辛酰胺、γ-谷氨酰谷氨酰胺、3-腺苷一磷酸、脱氢异雄酮、LysoPC(22:2(13Z,16Z))、二磷酸尿苷-N-乙酰氨基半乳糖、PE(15:0/14:1(9Z))、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、3-O-磺基半乳糖神经酰胺(d18:1/14:0)、 PE(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))、 N-琥珀酰-2-氨基-6-酮庚二酸、S-琥珀酰二氢硫辛酰胺、雄酮葡萄糖醛酸、2-(S-谷胱甘肽)乙酰谷胱甘肽、PC(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/P-16:0)、PC(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/P-18:1(11Z))表现为下降趋势。这些标记物主要与甘油磷脂代谢、醚脂类代谢、戊糖、葡萄糖醛酸转换、嘌呤代谢、糖基磷脂酰肌醇生物合成、淀粉和蔗糖代谢、原发性胆汁酸的生物合成、嘧啶代谢、谷胱甘肽代谢相关。(4)酒精诱导小鼠原代肝细胞损伤指纹轮廓及标记物分析建立适用于小鼠原代肝细胞代谢组学研究UPLC-HDMS的分析方法,对酒精性肝损伤小鼠的原代肝细胞进行代谢轮廓和模式识别分析。结果表明空白组与模型组小鼠原代肝细胞指纹代谢轮廓PCA分析显示样本明显分开。对造成这种代谢轨迹变化的潜在生物标记物进行表征,结合数据库检索鉴定出19个标记物。与正常组比较,模型组中的吲哚,4-羟基苯甲醛,L-亮氨酸,2-苯乙酰胺,苯丙酮酸,喹哪啶酸,5-羟乙醛,L-酪氨酸,吲哚乙酸,s-(2-甲基丁酰基)-二氢硫辛酰胺,lysoPC(14:1(9Z)),乳醛,L-乳酸,琥珀酸,二氢胸腺嘧啶,6-羟基己酸,N-琥珀酰-L,L-2,6-二氨基庚二酸,二十碳二烯酸表现为上调的趋势,1-苯乙胺表现为下调的趋势。并找到了8个相关的代谢通路：苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、甘油磷脂代谢、三羧酸循环、色氨酸代谢、泛醌等萜醌的生物合成。3茵陈蒿汤体内成分组方对酒精性肝损伤的影响连续7天后灌胃给予酒精性肝损伤小鼠茵陈蒿汤体内成分组方,分析临床化学指标、组织病理学指标,以及生物标记物的轨迹变化。结果治疗组小鼠AST、ALT、MDA、 TG、γ-GT含量明显降低,GSH含量显著升高；HE染色显示小鼠肝细胞排列规则,肝小叶结构接近恢复正常,中央静脉及肝窦仅见轻微扩张充血,汇管区血管增生等症状渐消失,肝组织整体形态趋近空白组；TUNEL原位末端凋亡检测显示,治疗组对酒精性肝损伤所致肝细胞凋亡有一定程度逆转作用,凋亡细胞面密度趋近空白组,与模型组相比具有极显著差异(P<0.01)。CASPASE-3活性检测显示治疗组对CASPASE-3活性有一定程度抑制作用,活性表达面密度值与模型组相比有极显著差异。尿液样本从主成分分析(PCA)得分图中可以观察到整体代谢轮廓逐步偏离损伤的病理状态,发现茵陈蒿汤体内成分组方治疗后,代谢物谱发生了明显变化,.异常代谢轮廓明显地向正常状态转归,具有显著改善酒精诱导肝细胞损伤作用。在代谢标记物层面,尿液样品茵陈蒿汤体内成分组方对发现的59个酒精性肝损伤潜在生物标志物,其中有49个回调作用;血液样品发现的29个酒精性肝损伤潜在生物标志物,其中有19个回调作用；肝组织样品对发现的30个酒精性肝损伤潜在生物标志物,其中有18个回调作用；小鼠原代肝细胞样品对发现的19个酒精性肝损伤潜在生物标志物,其中有17个回调作用。同时,基于治疗后的样品数据建立了相应的PCA模型,各组数据三组样本在主成分1(Component 1)维度均能明显的区分开,给药组中心点位于正常组和模型组之间,说明陈蒿汤体内成分组方对酒精诱导小鼠原代肝细胞损伤有一定保护作用。结论：酒精性肝损伤动物模型的主要生物标记物为苯乙胺、哌啶酸等,主要涉及苯丙氨酸等代谢通路,而茵陈蒿汤体内成分组方药物对酒精性肝损伤模型具有保护作用,不仅其能够显著调节各项生化指标,减轻脂肪变性及炎细胞浸润,而且通过回调小鼠代谢轮廓,逆转酒精性肝损伤生物标记物的异常表达水平并使之向正常状态回归,修复损伤导致的紊乱代谢通路,昭示6,7-二甲氧基香豆素、京尼平苷、大黄酸组方能够表达茵陈蒿汤的肝保护作用。