内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的成份,其主要组成部分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)。有研究显示LPS能够激活包括外周血单核细胞在内的各种细胞,能够诱导细胞分化成熟或产生各种内源性的活性物质,如TNFs,IFNs,ILs和CSFs等。现已发现许多细菌感染能触发或抑制细胞凋亡,并且有结果显示细菌引起的细胞凋亡中有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL(TNF-relate apoptosis-inducing ligand TRAIL)的参与。TRAIL又称为凋亡素2配体(APO-2L)。它属于TNF超基因家族成员,正如该家族的其他成员一样,TRAIL以Ⅱ型跨膜蛋白为主要表达方式。TRAIL能够诱导多种肿瘤细胞凋亡而对大多数正常细胞无影响。它通过与肿瘤细胞膜上的相应受体结合诱导细胞凋亡,目前已发现TRAIL有5个受体,其中TRAIL受体1(死亡受体4 death receptor 4, DR4)和TRAIL受体2(死亡受体5 death receptor 5, DR5)胞内段含有死亡结构域,能够传递凋亡信号,TRAIL通过与细胞膜上的DR4或DR5相互作用从而诱导细胞凋亡。在生理条件下DR5与TRAIL的亲和力明显大于DR4,因此,在TRAIL诱导细胞凋亡过程中起主要作用的受体是DR5。研究发现细菌内毒素可以诱导多种细胞凋亡,但内毒素引起细胞凋亡的机制还不完全清楚。内毒素引起细胞凋亡与TRAIL的相关性如何鲜见报道。为探索TRAIL在内毒素诱导细胞凋亡中的潜在作用,我们进行本项目的研究。
目的:主要探讨TRAIL的受体DR5在内毒素引起肝细胞凋亡中的作用及可能机制,并为进一步研究内毒素与其它细胞因子在肝细胞凋亡中的作用提供指导,同时也为临床上肝病治疗研究提供新的思路。
方法:实验分体外细胞学实验和动物实验两部分。
第一部分:体外细胞学实验,将人肝HL7702细胞常规培养贴壁后,分为对照组、内毒素处理组、抗人DR5单抗mDRA-6处理组及联合组(内毒素+ mDRA-6)。在做不同处理后倒置显微镜下观察L02细胞形态变化;MTT法检测内毒素对L02细胞生长的影响;流式细胞术检测L02细胞表面DR5的表达率;Annexin-V和PI双染法检测细胞凋亡率。
第二部分:动物实验,选用6-8周龄的健康BALB/c小鼠,实验分为三组:阴性对照组、单独内毒素处理组和DR5封闭TRAIL组。在做不同处理后检测小鼠血清中ALT、AST和LDH含量变化;HE染色镜下观察肝细胞凋亡;Annexin-V和PI双染法检测肝细胞凋亡率;流式细胞术检测肝细胞表面DR5的表达率;免疫组化检测肝细胞DR5的表达。
结果:
1.经LPS处理的L02细胞呈现明显的凋亡形态特征,出现核固缩、染色质边缘化、凋亡小体形成。流式细胞术分析表明:对照组L02细胞表面DR5的表达率为4.8%,用LPS (10 mg/L)处理12 h后,DR5表达率上调为37.76%。L02细胞12h凋亡率:LPS处理组、抗人DR5单抗mDRA-6处理组、LPS联合mDRA-6组细胞凋亡率分别为37.78%(早期凋亡21.65%,晚期凋亡16.13%)、29.58%(早期凋亡18.21%,晚期凋亡11.37%)和65.81%(早期凋亡50.61%,晚期凋亡15.20%)(p<0.05)。
2.经LPS处理后小鼠血清中ALT、AST和LDH的含量随着时间延长呈进行性升高,在处理24h三种酶的含量达到最高峰,随后开始下降。HE染色镜下观察单独内毒素处理组肝细胞凋亡较多,可见细胞体积缩小,胞质致密深染,形成致密质块,并出现凋亡小体。DR5封闭TRAIL组细胞凋亡减少。流式检测小鼠肝细胞凋亡率:单独内毒素处理组细胞凋亡率为45.02%(早期凋亡为13.59%,晚期凋亡为31.43%)。DR5封闭TRAIL组小鼠肝细胞凋亡率27.62%(早期凋亡为11.47%,晚期凋亡为16.15%);免疫组化染色观察细胞DR5的表达:单独内毒素处理组小鼠肝细胞DR5的表达率比对照组明显增高。流式检测对照组小鼠肝细胞表面DR5的表达率是4.21%;单独内毒素处理组小鼠肝细胞DR5的表达率明显增高为46.71%。
结论:1.内毒素可以通过上调细胞表面DR5的表达诱导人肝细胞凋亡,细胞凋亡率与内毒素的剂量及细胞表面DR5表达率呈相关性,内毒素引起的人肝细胞凋亡是TRAIL的受体DR5起主要作用。
2.内毒素可以诱导小鼠肝细胞凋亡,并且在内毒素诱导下细胞表面DR5的表达率明显增高。sDR5可以和小鼠体内的TRAIL相结合使肝细胞凋亡减少,内毒素可以通过上调小鼠肝细胞表面DR5的表达来诱导细胞凋亡,内毒素诱导的细胞凋亡与TRAIL系统相关联。
