NF-kB p65基因沉默对雌激素诱导的人肝细胞BSEP/NTCP表达的影响

目的： 通过特异性的siRNA沉默NF-κB p65基因表达,探索其对17β雌二醇(E2)诱导L-02人正常肝细胞中胆盐输出泵(BSEP)、钠-牛磺胆酸共转运子(NTCP)表达的影响。 方法： 1.人肝细胞的培养,Western bloting方法对该细胞中BSEP、NTCP表达阳性的验证。 2.NF-kB siRNA的合成、筛选。应用荧光标记的人工合成NF-kB p65 siRNA序列和LipofectamineTM2000进行转染率的筛选实验。用Real-time PCR进行NF-κB p65-siRNA有效序列的筛选。 3.采用实时荧光定量PCR及Western bloting方法,检测雌激素诱导的人肝细胞NF-kB p65基因沉默前后BSEP、NTCP mRNA及蛋白表达水平,明确NF-kB对人肝细胞中BSEP、NTCP表达的影响。 结果： (1)正常人肝细胞中BSEP及NTCP均有表达 (2)雌激素对肝细胞中NF-κB表达升高及NF-kB siRNA最佳片段的筛选。 NF-κB在500nmol/L E2作用的L-02肝细胞24小时后,其蛋白表达量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；应用转染试剂在同一优化条件下,L-02细胞可成功转染,转染效率达70%。siRNA 1049有最佳沉默NF-kB基因的作用,与空白对照组比较,沉默效果明显(P<0.05),转染24小时以后沉默效率达到70%。NF-κB p65基因表达水平在转染后24小时抑制明显,较阴性对照组及空白对照组有明显差异(P<0.05)。 (3)沉默NF-κB p65表达对雌激素诱导肝细胞中BSEP、NTCP表达增强。 干扰组中BSEP、NTCP mRNA及蛋白表达均高于空白对照组及未干扰组,差异有统计学意义(P<0.05)；而空白对照组与未干扰组BSEP及NTCP表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。 结论： 1.特异性siRNA可有效下调雌激素诱导的肝细胞中NF-kB的表达 2.通过siRNA沉默NF-kB,可下调雌激素诱导下肝细胞BSEP及NTCP的表达； 3.NF-kB可能参与了E2诱导的肝细胞下调BSEP及NTCP的表达。