转rolB基因改良毛白杨生根能力的研究

毛白杨具有速生丰产、材质优良等优点,是我国北方地区一个重要的建筑、家具用材和纸浆纤维工业原料树种。但与大多数其他杨树不同,毛白杨扦插繁殖不易生根,成苗率极低,育苗成本高,严重阻碍了以无性繁殖技术对这一优良树种进行繁殖与推广应用。因此,改良其生根性状,提高硬枝扦插生根能力已成为毛白杨遗传改良的重要研究课题。本文以普通毛白杨为研究对象,通过对离体叶片再生条件、抗生素筛选条件以及根癌农杆菌介导毛白杨遗传转化条件的优化,建立了高效离体再生系统和遗传转化体系,并将rolB诱根基因导入毛白杨,对转化再生植株进行了分子检测及离体生根能力的初步研究,主要研究内容及结果如下: 1.利用限制性内切酶EcoRⅠ将GH3启动子-rolB基因-nos终止子表达框架从质粒载体pUC-GH3-rolB-nos中切下,克隆到具有卡那霉素抗性基因的双元质粒pBin19中,构建了植物表达载体pBinGH3rolBnos,并通过液氮冻融法将其导入农杆菌LBA4404,用于毛白杨的遗传转化试验。 2.利用正交试验设计进行了叶片外植体高效再生系统建立的研究,筛选出毛白杨叶片分化不定芽的适宜培养基为:MS+6-BA1.0mg/L+ZT0.3mg/L+NAA0.3mg/L。并以此最佳不定芽诱导培养基为基本培养基配方,比较了六个不同无性系分化能力的差异,研究了同一植株不同叶位的叶片、不同外植体类型对再生能力的影响,结果表明,不同基因型其叶片再生能力差异显著,6个供试无性系中,以L5和L2再生能力最强,叶片再生率分别达98.3%和91.7%。叶片、茎段和根段三种外植体类型的再生频率大小顺序依次为叶片(95.1%)>茎段(66.3%)>根段(61.5%)。 3.通过卡那霉素敏感性试验,确定了叶片外植体不定芽诱导卡那霉素临界耐受浓度为20mg/L,试管苗不定根再生临界敏感浓度是25mg/L。同时研究了头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Cb)对毛白杨叶片芽诱导及试管苗再生不定根的影响及对农杆菌的抑菌效果,发现两种脱菌剂浓度超过400mg/L时对叶片外植体不定芽和试管苗不定根的诱导有抑制作用,且随着浓度升高抑制程度加大。抑菌试验表明,Cef对LBA4404和C58C1菌株的抑菌效果比Cb好,适宜的脱菌浓度为200～400mg/L。 4.对影响农杆菌转化效率几个主要因素进行的研究发现,毛白杨叶片外植体在农杆菌浸染前预培养2d,感染后共培养2～4d可获得较好的转化效果;在共培养基中附加200μM的乙酰丁香酮,可以使LBA4404和C58C1两个菌株的转化率分别提高3.13和7.5个百分点。胭脂碱型C58菌株介导基因转移能力明显高于章鱼碱型LBA4404株系。 5.分别将含质粒pBinGH3rolBnos的农杆菌LBA4404和含pCMB-B:GUS质粒的农杆菌C58C1与毛白杨叶片共培养,通过在30mg/L和50mg/L卡那霉素的培养基上