Nrf2、HO-1在实验性大鼠脑缺血再灌注模型中的动态表达及氧化苦参碱的神经保护作用

目的:缺血性脑血管病是常见病、多发病,病死率和致残率均较高。早期溶栓治疗是急性期脑梗死有效的治疗方法。脑缺血再灌注损伤机制包括相互承启、交互作用的数个机制,如兴奋性氨基酸毒性作用、炎症、细胞凋亡等。氧化应激时活性氧增加,氧化应激时可通过激活氧化还原反应敏感的炎症趋化因子和转录因子Nrf2,使组织损伤时炎症反应增加。近年研究显示Kelch-like ECH -associated protein1(Keap1)- Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)/ antioxidant response element (ARE)通路是细胞内重要的抗氧化及细胞毒防御机制之一,Nrf2是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子。通过上调此信号通路可诱导多种抗氧化酶及解毒酶,加速酶促反应,提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物质的表达水平,清除自由基等氧化物质,维持细胞内的氧化还原水平状态,发挥细胞保护作用。 本实验成功建立了大鼠脑缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion/ reperfusion, MCAO/R)模型,测定了不同时间点大鼠脑组织中Nrf2及Ⅱ相酶血红素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)的表达水平,以及OMT在脑缺血损伤中的神经保护作用及其对Keap1-Nrf2/ARE通路的上调作用。 方法:⑴成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为三组:大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebral arteryocclusion/ reperfusion, MCAO/R)生理盐水组(MCAO/R+NS 3 ml/kg)(简称MCAO/R组)、大脑中动脉闭塞/再灌注OMT组(MCAO/R+OMT 120 mg/kg )(简称OMT组)、Sham组,每组按时间分为术后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 6个亚组。按照改良的拴线法建立大脑中动脉缺血再灌注动物模型。OMT组动物梗死后立即腹腔注射120 mg/kg的氧化苦参碱,以后每天一次。MCAO/R组和Sham组给予等体积生理盐水。术后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h对大鼠进行神经功能评分,评分完毕将动物断头处死,用干湿重法测定脑组织含水量,用免疫组化法检测Nrf2和HO-1的表达。⑵测定蛋白表达:其中用于观测动态表达大鼠,随机分为7组:①MCAO/R 3 h组;②MCAO/R 6 h组;③MCAO/R 12 h组;④MCAO/R 24 h组;⑤MCAO/R 48 h组;⑥MCAO/R 72 h组;⑦Sham组。用于观测OMT疗效大鼠,随机分为3组:①MCAO/R组;②OMT组;③Sham组,均为手术后48 h组。用免疫印迹法(Western blot)检测Nrf2和HO-1蛋白的表达情况。⑶用于脑梗死体积测定的大鼠,随机分为3组:①MCAO/R组;②OMT组;③S ham组,术后72 h处死用2,3,5三苯基四唑氮红(triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色。 结果: 1 MCAO/R和OMT组大鼠均出现不同程度的左侧肢体偏瘫。OMT组的神经功能评分低于MCAO/R组(P<0.05)。 2 Sham组无梗死灶。与MCAO/R组相比,OMT组梗死体积明显减小(P<0.01)。 3 MCAO/R组和OMT组脑组织含水量均在术后6 h开始升高,48 h达高峰,72 h开始下降,与Sham组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。与MCAO/R组相比,OMT组的脑组织含水量明显下降(P<0.05)。 4脑缺血6 h后Nrf2核阳性细胞数MCAO/R组和OMT组增多,48 h达高峰,72 h逐渐下降,与Sham组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。OMT组核阳性细胞数明显多于MCAO/R组(P<0.01)。Western blot显示,MCAO/R组与Sham组相比,在各个时间点Nrf2总蛋白的表达没有明显变化(P>0.05);与MCAO/R组及Sham组相比,OMT组在48h时间点Nrf2总蛋白的表达明显增加(P<0.05)。 5脑缺血6 h后HO-1的阳性细胞数MCAO/R组和OMT组开始增多,48 h达高峰,72 h逐渐下降,与Sham组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。OMT组较MCAO/R组HO-1表达量明显增加。Western blot显示,MCAO/R组与Sham组相比,在各个时间点HO-1总蛋白的表达与免疫组化的变化规律相似(P<0.01);与MCAO/R组、Sham组相比,OMT组在48h时间点HO-1总蛋白的表达明显增加(P<0.01)。结论:Nrf2及HO-1在大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注后的脑组织中早期即有表达增高。氧化苦参碱干预后,缺血性脑组织脑含水量降低,梗死体积减小,神经功能症状缺损评分降低,并上调了Nrf2及HO-1的表达水平,氧化苦参碱对缺血性脑组织有脑保护作用,推测Keap1-Nrf2/ARE信号通路参与了氧化苦参碱的脑保护作用。