微小RNA-128通过靶向NRF2调控心肌缺血再灌注损伤的研究

目的:心肌梗死是导致冠心病患者死亡的主要原因。目前,溶栓治疗或早期介入手段为缺血部位恢复血液灌流,可以有效改善心肌缺血或者坏死。但是,心肌长时间缺血再重新灌流后,会导致部分心肌细胞死亡和心脏功能的损失,即缺血再灌注损伤。MicroRNA（miRNA,miR）是一类小的非编码RNA分子。近年来的研究表明,miRNA在心肌缺血再灌注损伤中的作用日益重要。转录因子NF-E2相关因子2（Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2）-抗氧化反应元件（antioxidant response element,ARE）是一种十分重要的内源性抗氧化应激通路。在心肌细胞中,Nrf2蛋白的表达增加,可以有效减轻心肌细胞损害,从而显著改善心脏功能。本研究主要集中于分析miR-128在预防心肌缺血再灌注损伤中的重要作用。通过探讨miR-128在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制,为治疗缺血性心肌细胞超微结构的损害和改善心脏功能提供新的治疗策略方法:1.收集40例急性心肌缺血以及30例健康对照患者,从肘静脉采集研究对象外周血中miR-128表达水平。2.构建大鼠心肌缺血模型。用免疫组化和实时定量PCR方法检测miR-128和Nrf2的m RNA水平。3.双荧光素酶报告基因检测Nrf2是否是miR-128的靶基因。4.分别构建高表达和低表达miR-128的腺病毒载体,并将其注射入大鼠心肌组织内。收集心肌组织,检测ROS水平、细胞凋亡情况、心脏功能改善情况（+dp/dtmax、LVSP、LVEDP）。Hoechst染色法、流式细胞术及TUNEL染色法检测大鼠心肌细胞的凋亡情况。5.透射电镜观察线粒体损伤情况。结果:1.在急性心肌缺血患者血清中miR-128表达水平升高。2.在缺血再灌注损伤的大鼠模型中,miR-128的表达水平增加,Nrf2的表达降低。3.体外研究H2O2刺激会显著诱导miR-128水平升高。通过生物信息学的分析发现,在Nrf2的3’UTR区有一个保守的结合位点。双荧光素酶报告基因分析的结果表明,miR-128可以有效抑制荧光素酶的活力。4.体内研究发现,过表达miR-128可以有效抑制Nrf2的表达,而抑制miR-128的水平可以增加心肌细胞中Nrf2的表达情况。伴随着心肌细胞中Nrf2表达水平的升高,其下游基因HO1、NQO1、SOD1水平升高。在大鼠心肌组织中抑制miR-128后,抗氧化相关酶的表达水平随之升高,而心肌组织中ROS水平明显下调。同时,抑制miR-128可以有效降低心肌细胞的凋亡并改善缺血再灌注损伤后的心肌功能。5.透射电镜分析发现,与正常对照相比,缺血/再灌注损伤组中,心肌组织中线粒体严重肿胀、呈现空泡状、心肌细胞的内外膜结构不完整。与之相反,在心肌组织中抑制miR-128以后,心肌细胞中线粒体肿胀的现象明显得到缓解。结论:1.心肌缺血的患者血清中miR-128表达水平升高。2.H2O2诱导原代心肌细胞miR-128表达水平的升高。miR-128通过调控Nrf2影响细胞凋亡。3.心肌缺血再灌注损伤模型中miR-128表达水平的升高,抑制miR-128影响ROS水平,减少心肌组织凋亡细胞数,从而影响心肌损伤。