细胞外钙调素对花粉细胞内钙离子的影响及其信号传递途径的研究

以川百合花粉为材料,建立了改进的低温装载方法,在完整的花粉粒中装载了钙离子荧光指示剂fluo-3,利用激光共聚焦显微技术研究了细胞外钙调素对花粉细胞内游离钙离子浓度的影响,并对其信号转导途径进行了探索。结果如下: 在完整花粉粒细胞内装载酯化形式的荧光指示剂时,克服细胞壁中的非特异性脂酶是保证成功装载的关键。在常温条件下装载钙离子荧光指示剂成功率比较低、效果不稳定,而利用低温装载的方法则可以通过抑制细胞壁中的脂酶收到良好的装载效果。 外加纯化钙调素可以促进花粉细胞内游离钙离子水平提高,以10-7mol/L的钙调素作用效果最强,低于或超过这一浓度,钙调素的作用效果均有所降低;说明外源纯化钙调素可以作为一种信号,刺激钙离子进入花粉细胞质,作为第二信使发挥作用。不能透过细胞膜的钙调素抗血清和大分子钙调素拮抗剂W7-agarose 处理后细胞内钙离子水平降低,免疫前血清对花粉细胞内钙离子浓度没有明显影响;进一步支持了上述结果,并且表明内源细胞外钙调素在维持和提高细胞内钙离子浓度方面发挥作用。 花粉细胞质膜上异三聚体G 蛋白的活性影响花粉细胞内钙离子浓度。G 蛋白的激活剂霍乱毒素(CTX)处理后,花粉细胞内钙离子浓度升高;而其抑制剂百日咳毒素(PTX)处理则使细胞内钙离子水平降低。在G 蛋白活性受到PTX的抑制后,钙调素处理不能对花粉细胞内钙离子浓度产生明显影响;而钙调素的大分子拮抗剂处理后,再加入CTX 处理,细胞内钙离子浓度迅速升高,表明细胞外钙调素的拮抗剂对CTX 的作用效果没有影响。上述结果表明G 蛋白在细胞外钙调素促进细胞内钙离子水平升高的过程中发挥重要作用,而且在信号转导过程中位于钙调素的下游。 细胞质膜上钙离子通道的活性影响细胞内钙离子水平,经电压门控钙离子通道抑制剂异搏定(verapamil)处理后,细胞内钙离子水平降低,而另一种钙离子通道抑制剂尼群地平(nifedipine)对花粉细胞内钙离子水平没有影响。表