5-HT1B/1D受体激动剂对偏头痛的治疗机制研究

背景与目的5-HT1B/1D受体激动剂（曲普坦类药物）是基于偏头痛发病的神经血管学说发展起来的一类治疗偏头痛的特异性药物，对偏头痛的治疗机制主要是作用于脑血管壁的5-HT1B/1D受体，收缩偏头痛发作时扩张的脑血管。鉴于5-HT1B/1D受体激动剂对偏头痛治疗的满意效果，我们在一项抗偏头痛药物研究中以5-HT1B/1D受体激动剂的代表药“利扎曲普坦”作为阳性对照药物，结果却发现利扎曲普坦能够抑制中脑P物质及脑啡肽原基因的表达，而P物质和脑啡肽正是在中脑发挥镇痛作用的重要肽类物质，由此引起了我们对5-HT1B/1D受体激动剂治疗偏头痛机制研究的兴趣。目前研究发现，5-HT1B/1D受体激动剂对偏头痛的治疗作用还与其影响三叉神经末端及脑干二级感觉神经元的功能有关，而对偏头痛发作时外周血中细胞因子及三叉神经节功能的影响研究较少；对内源性痛觉调制系统的功能有无影响，如何影响，尚无相关研究。本研究以硝酸甘油型偏头痛大鼠为体内实验的动物模型，观察利扎曲普坦对偏头痛发作时外周血中疼痛相关细胞因子、三叉神经节中疼痛相关神经肽及内源性痛觉调制系统的核心结构中脑导水管周围灰质痛觉调制功能的影响；体外实验以热刺激原代培养的三叉神经节神经元作为细胞模型，观察利扎曲普坦对热刺激三叉神经节神经元疼痛相关神经肽的影响，对5-HT1B/1D受体激动剂治疗偏头痛的机制进行较为系统地研究。 方法 1.体内实验 ⑴动物分组、造模与干预、行为学观察：将48只Wistar大鼠随机分为4组，每组12只：对照组（A）、偏头痛组（B）、利扎曲普坦对照组（C）、利扎曲普坦治疗组（D）。C组和D组大鼠给予苯甲酸利扎曲普坦1mg/（kg·d）灌胃（药物剂量根据成人每日常规口服剂量进行换算），A组和B组大鼠给予生理盐水灌胃（1mL/d）。各组大鼠连续灌胃给药7d后，B组和D组大鼠制备硝酸甘油型偏头痛动物模型。记录各组大鼠给予药物（硝酸甘油注射剂或生理盐水）后60min至90min期间，各组大鼠挠头、爬笼、咬尾、往返运动的次数总和（上述4个症状每出现1次得1分）。 ⑵各组大鼠血浆中CGRP、5-HT、IL-1β、TNF-α含量检测：每组大鼠各6只，采外周血（B、D组大鼠给予硝酸甘油注射剂2h时），应用ELISA检测各组大鼠血浆中CGRP、5-HT、IL-1β、TNF-α的含量； ⑶各组大鼠三叉神经节PENK、SP、CGRP、CCK mRNA表达：每组大鼠各6只，取三叉神经节（B、D组大鼠给予硝酸甘油注射剂2h时），利用SYBRGreen I实时定量PCR检测各组大鼠三叉神经节PENK、SP、CGRP、CCK mRNA的表达； ⑷各组大鼠中脑ENK、SP、CGRP、CCK的表达：每组大鼠各12只，取中脑（B、D组大鼠给予硝酸甘油注射剂2h时），其中6只大鼠应用SYBR GreenI实时定量PCR检测中脑PENK、SP、CGRP、CCK mRNA的表达；另外6只大鼠应用免疫组织化学检测中脑导水管周围灰质M-ENK、L-ENK、SP、CGRP、CCK-8的表达； 2.体外实验 ⑴三叉神经节神经元的原代培养：取出生3-5日SD大鼠的双侧三叉神经节，进行分离、消化及离心，接种于24孔培养板，原代培养三叉神经节神经元。 ⑵热刺激方法：三叉神经节神经元培养至第7日，放入38.5℃环境中培养30min。 利扎曲普坦干预方法：三叉神经节神经元培养至第7日，加入1mmol/L的甲酸利扎曲普坦（工作浓度20μM）20μL培养1h。 ⑶实验分组：分4组，每组6个培养孔。对照组（A）：常规三叉神经节神经元培养组；热刺激组（B）：三叉神经节神经元培养至第7日，放入38.5℃恒温水浴箱培养30min；利扎曲普坦对照组（C）：三叉神经节神经元培养至第7日，加入1mmol/L的苯甲酸利扎曲普坦20μL培养1h；利扎曲普坦+热刺激组（D）：三叉神经节神经元培养至第7日，加入1mmol/L的苯甲酸利扎曲普坦20μL于37℃二氧化碳培养箱中培养1h，之后全量换液，放入恒温水浴箱（38.5℃）培养30min。 ⑷SYBR Green I实时定量PCR检测各组三叉神经节神经元PENK、SP、CGRP、CCK mRNA的表达。 结果 1.体内实验 ⑴各组大鼠行为学评分比较：利扎曲普坦治疗组大鼠行为学评分明显低于偏头痛组大鼠。 ⑵各组大鼠血浆中CGRP、5-HT、IL-1β、TNF-α含量的比较：①偏头痛组大鼠外周血浆中CGRP含量明显高于对照组，利扎曲普坦给药组大鼠外周血浆中CGRP含量与对照组及偏头痛组比较无显著差异；②利扎曲普坦对照组大鼠外周血浆中5-HT含量明显高于对照组和偏头痛组，利扎曲普坦治疗组大鼠外周血浆中5-HT含量明显高于偏头痛组；③各组大鼠外周血浆中IL-1β含量相比均无显著性差异；④各组大鼠外周血浆中TNF-α含量相比均无显著性差异。 ⑶各组大鼠三叉神经节PENK、SP、CGRP、CCK mRNA表达：①偏头痛组、利扎曲普坦治疗组大鼠三叉神经节PENK mRNA拷贝数明显低于对照组和利扎曲普坦对照组；利扎曲普坦对照组大鼠三叉神经节PENK mRNA拷贝数明显高于对照组；利扎曲普坦治疗组大鼠三叉神经节PENK mRNA拷贝数明显高于偏头痛组；②利扎曲普坦对照组大鼠三叉神经节SP mRNA拷贝数明显高于对照组和偏头痛组；偏头痛组大鼠三叉神经节SP mRNA拷贝数稍低于对照组，差异无显著性，但利扎曲普坦治疗组大鼠三叉神经节SP mRNA拷贝数明显低于利扎曲普坦对照组；③偏头痛组、利扎曲普坦治疗组大鼠三叉神经节CGRPmRNA拷贝数明显高于对照组和利扎曲普坦对照组；④对照组、偏头痛组、利扎曲普坦对照组和利扎曲普坦治疗组大鼠三叉神经节CCK mRNA拷贝数比较均无显著差异。 ⑷各组大鼠中脑ENK、SP、CGRP、CCK表达：①利扎曲普坦给药组大鼠中脑PENK mRNA拷贝数明显低于对照组和偏头痛组；对照组大鼠中脑导水管周围灰质区滑车神经核水平M-ENK阳性细胞数明显少于偏头痛组；利扎曲普坦对照组大鼠中脑导水管周围灰质区M-ENK阳性细胞数明显多于对照组；②偏头痛组大鼠中脑SP mRNA拷贝数明显低于对照组；利扎曲普坦给药组大鼠中脑SPmRNA拷贝数明显低于对照组和偏头痛组；对照组大鼠中脑导水管周围灰质区SP阳性细胞数明显多于利扎曲普坦对照组；偏头痛组大鼠中脑导水管周围灰质区SP阳性细胞数明显多于利扎曲普坦治疗组；③利扎曲普坦治疗组大鼠中脑CGRP mRNA拷贝数明显低于偏头痛组；偏头痛组大鼠中脑导水管周围灰质区CGRP阳性细胞数明显多于利扎曲普坦给药组；④利扎曲普坦给药组大鼠中脑CCK mRNA拷贝数明显低于对照组和偏头痛组；对照组大鼠中脑导水管周围灰质区CCK-8阳性细胞数明显多于利扎曲普坦对照组，偏头痛组大鼠中脑导水管周围灰质区CCK-8阳性细胞数明显多于利扎曲普坦治疗组。 2.体外实验 ⑴热刺激组三叉神经节神经元CGRP mRNA拷贝数明显高于对照组；利扎曲普坦对照组三叉神经节神经元CGRP mRNA拷贝数明显低于对照组；利扎曲普坦+热刺激组三叉神经节神经元CGRP mRNA拷贝数明显低于热刺激组。 ⑵热刺激组三叉神经节神经元PENK mRNA拷贝数明显低于对照组；利扎曲普坦对照组和利扎曲普坦+热刺激组三叉神经节神经元PENK mRNA拷贝数明显低于对照组和热刺激组。 ⑶热刺激组三叉神经节神经元SP mRNA拷贝数明显低于对照组；利扎曲普坦对照组和利扎曲普坦+热刺激组三叉神经节神经元SP mRNA拷贝数明显低于对照组和热刺激组。 ⑷对照组、热刺激组、利扎曲普坦对照组和利扎曲普坦+热刺激组三叉神经节神经元CCK mRNA拷贝数比较均无显著差异。 结论 1.硝酸甘油型偏头痛大鼠外周血中5-HT含量有下降趋势；5-HT1B/1D受体激动剂能够影响外周5-HT系统的代谢状态，提高偏头痛大鼠头痛发作期外周血中5-HT含量，从而改善偏头痛发作时血管舒缩功能紊乱的状态。 2.偏头痛发作时三叉神经节表达CGRP增加，5-HT1B/1D受体激动剂可以抑制三叉神经节神经元表达CGRP，减轻CGRP引发的神经源性炎症。 3.偏头痛发作时三叉神经节表达PENK减少，5-HT1B/1D受体激动剂可以上调三叉神经节神经元PENK基因表达，发挥镇痛作用。 4.5-HT1B/1D受体激动剂可以促进PAG区表达M-ENK，进而发挥镇痛作用。 5.5-HT1B/1D受体激动剂抑制偏头痛发作时PAG区CGRP的表达，一方面可以减轻CGRP所引发的偏头痛病理生理改变；另一方面可以减弱CGRP对阿片镇痛的抑制效应，发挥治疗偏头痛的作用。 6.5-HT1B/1D受体激动剂抑制PAG区CCK-8的表达，从而减弱CCK对阿片镇痛的拮抗作用，一定程度上增强了内源性阿片肽的镇痛效应。